3D打印PLLA/HA復合組織工程骨支架及性能表征

任澤宇，姜 宏，石永芳

(1.新疆大學 機械工程學院,新疆 烏魯木齊 830047；2.新疆醫科大學 醫學工程技術學院,新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

近年來，組織工程骨支架已成為治療因創傷、感染、骨腫瘤切除等因素而導致的骨缺損的重要手段[1-2]。在骨缺損修復治療中植入組織工程骨支架，為細胞的依附、增殖、分化提供微環境，促進和誘導新骨再生，以達到骨修復的目的[3-4]。理想的組織工程骨支架要求具有合適的力學強度、可降解性以及良好的生物安全性，同時也應具備一定的三維微孔結構，為細胞的營養滲入和產物代謝提供物質交換的通道。3D打印技術的出現，使構建復雜形態的組織工程骨支架成為了可能，與傳統組織工程骨支架相比，3D打印出的復合支架具有多孔結構，有利于細胞的增殖、依附和物質交換，且可根據患者缺損部位的大小和形態，實現個性化骨支架的制備。羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)作為骨骼中主要的無機鹽成分，具有大的比表面積、良好的生物相容性和骨誘導能力，是常見的骨組織修復材料。Leukers等人[5]在體外研究中，通過3D打印技術制備出可改善骨缺損修復的多孔HA支架，誘導小鼠細胞在孔隙間增殖分化，表現為多孔HA對骨生長具有良好的促進作用，但是純HA支架存在強度低、脆性大、不易降解等問題。因此，需對HA進行表面改性處理來提高其機械性能和降解性能。在有機高分子材料中，聚乳酸類材料具備良好的組織相容性、可降解性和易加工性，被普遍認為是制備復合新型人工骨的最佳聚合物材料[6]。王立等人[7]用聚左旋乳酸(Poly-L-Lactic Acid，PLLA)制備的可降解骨折內固定器械，具有可完全降解吸收等優點；修凱華等人[8]將PLLA加入接骨板內固定系統中發現PLLA具有與人體相匹配的彈性模量；廖建國等人[9]發現HA降解產物呈堿性，加入PLLA，不僅調節了HA的降解速率，還因PLLA的降解產物為酸性，可中和HA降解后的堿性產物。因此，PLLA支架具有良好的力學性能和降解性能，為了加快HA支架的降解速度，本研究通過擠出成型3D打印技術，制備不同質量分數PLLA/HA復合的多孔生物可降解骨組織工程支架，對其物理性能、降解規律和細胞毒性進行實驗和分析，探究骨支架材料的可行性和安全性，為后期進一步體內降解和動物實驗提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

HA(粒徑40 nm，純度96%，南京愛普瑞納米材料有限公司)，PLLA(重均分子量20×105，山東岱罡生物)，1,4-二氧六環(分析純)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS，碧云天生物技術研究所)，模擬體液(Simulated Body Fluid，SBF，雷根生物公司)，DMEM低糖培養基，胎牛血清(Gibco，美國)，CCK-8試劑盒(同仁化學研究所(Dojindo)開發)，兔子成骨細胞(新疆醫科大學第一附屬醫院動物中心提供)。

1.2 實驗儀器

3D打印機(新疆大學自研)，微機控制電子萬能試驗機(方辰儀器設備有限公司)，HH-1 數顯恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器廠)，高精度數字電子秤(浙江凱豐集團有限公司)，冷凍干燥機(力辰科技有限公司)，CO2培養箱(美國Thermo Fisher)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，全自動酶標儀(美國BioTek)。

1.3 骨支架制備

以HA為對照，按設計要求10%、20%、30%、40%、50%稱取PLLA，將PLLA與1,4-二氧六環溶液按照溶質比1∶2混合，在磁力攪拌器中攪拌2 h至透明膠狀并揮發出1,4-二氧六環。將膠狀PLLA與HA粉末共混，繼續攪拌直至形成可打印的白色膏狀物，均勻裝入擠出料筒之后，按照圖1復合支架結構設計編譯G代碼，采用3D打印機進行打印。因隨PLLA質量分數增加，復合支架黏度增大，經實驗表明，每增加10% PLLA含量，出絲速率需提高2 mm/h，防止打印噴頭堵頭，使出絲速率與運動控制平臺速率相匹配，以保證骨支架的良好制備。由于1,4-二氧六環具有毒性且極易揮發，利用冷凍干燥抽真空法去除支架中殘留1,4-二氧六環并對支架定形。

圖1 復合支架結構設計Fig.1 Structural design of composite scaffold

圖2 打印出的復合支架Fig.2 Printed composite scaffold

1.4 復合材料性能測試

1.4.1力學性能測試

骨支架需在人體中承受一定壓力，因此需對骨支架力學性能進行測試。將PLLA/HA支架放置于電子萬能試驗機上進行力學試驗。實驗共分為5組，選擇出絲直徑為0.84 mm的打印針頭，通過3D打印機打印出10 mm×10 mm×8.4 mm大小的骨支架。室溫環境下進行測試。采用1 kN的傳感器，壓縮速度為1 mm/min，每組選取6個樣品。繪制應力-應變曲線，檢測其最大抗壓強度、最大形變等力學數據。

1.4.2微觀形貌檢測

選擇1.4.1力學性能測試中形貌大小相同的骨支架，每組取6塊樣品，表面噴金，使用MERLIN Compact(德國蔡司)場發射掃描電子顯微鏡觀察表面的超微形態結構，并隨機選擇樣品表面不同區域采集圖像。

1.4.3接觸角測試

材料的親水性是影響細胞依附和蛋白質通過的重要屬性[10]，因此實驗對該性能進行測試研究。由HA和PLLA制備的復合支架具有大量的親水基團-羥基和羧基，測試支架表面接觸角，研究PLLA的加入對支架親水性的影響變化。制備20 mm×15 mm×2 mm的支架薄片，冷凍干燥后放置于接觸角測定儀，同一樣品測試3個不同部位，取平均值。

1.4.4傅立葉紅外光譜

將干燥樣品粉碎，在紅外光譜儀上掃描32次，分辨率4 cm-1，測定范圍為400～4 000 cm-1，使用Origin 9.1作圖分析。

1.4.5支架失重率測試

將打印好的支架放入15 mL離心管中，加入10 mL SBF人體模擬液(pH值7.4～7.5)，放入恒溫水浴振蕩器中振蕩，每隔7 d測量pH值并換液，2 w，4 w，6 w，8 w，10 w后取出各組支架，去離子水沖洗表面，冷凍干燥24 h，稱重。

1.4.6細胞毒性檢測

為測定支架材料以及殘留1,4-二氧六環的毒性，對支架整體進行細胞毒性測試。按照GB/T16886.12—2005標準制備浸提液，按設計要求稱取冷凍干燥后的50% PLLA/HA復合支架50 mg，進行高溫高壓蒸汽滅菌處理，按50 mg/mL浸提比例加入細胞培養基。以兔子成骨細胞為材料，培養1代后制備濃度為1×104個/cm3細胞懸液，分別接種在3個96孔板內，每組設3個孔為平行實驗，以空白培養基為對照組，每孔加入100 μL細胞懸液，靜置4 h待細胞完全貼壁，去除原培養基，加入10 μL浸提液。將細胞培養板在37 ℃，5% CO2培養箱中培養1 d、3 d、5 d取出，加入10 μL CCK-8試劑孵育4 h后，用酶標儀測定在450 nm每個孔的吸光度值，最后進行細胞相對增殖率(R)計算，計算公式為

(1)

式中，x為實驗組吸光度值，y為對照組吸光度值，z為空白組吸光度值。

2 結果與討論

2.1 力學性能分析

復合支架的力學強度是由其制備材料的聚合形態、材料在料筒中的分散程度以及表面結合強度等多種因素共同決定的[11]。本實驗中，PLLA作為改性材料用以調節HA力學性能。為了得到最佳力學性能，實驗制備了PLLA質量分數分別為10%、20%、30%、40%、50%的復合材料進行對比測試。結合后期使用環境，以最大抗壓強度為指標來評價復合支架材料的力學性能，并繪制應力應變曲線。

由圖3復合支架抗壓強度圖可以看出，通過擠出成型打印機打印出的復合支架的抗壓強度與支架內PLLA的含量成正比關系。當PLLA的質量分數為10%、20%時，支架的抗壓強度有小幅度升，但不滿足動物體內回植實驗所需的最低抗壓強度2.5 MPa[12]，故后續實驗不再進行驗證分析。當復合骨支架PLLA質量分數為30%、40%和50%時，復合支架的抗壓強度有了明顯的提升，三組復合支架的最大壓縮強度分別為(3.07±0.31)MPa、(3.99±0.29)MPa和(5.54±0.36)MPa。這是因為隨著PLLA質量分數的增加，HA顆粒減少，支架中形成的連續相增加，減少了材料表面的斷裂和缺陷，從而增強了復合支架的抗壓強度。

圖3 復合支架抗壓強度圖Fig.3 Composite support compressive strength diagram

由圖4復合支架應力應變曲線圖可以看出，當復合支架負載相同壓力時，復合支架發生形變的形變量隨PLLA的質量分數的提升而減小，這是因為HA微粒之間不具備自發結合能力，PLLA質量分數增加，加強了材料結構之間的連續性。當PLLA的質量分數由30%至50%轉變時，復合支架的韌性有相應的提升，故當抗壓強度一致時，PLLA質量分數為50%的復合支架發生形變的形變量最小。綜上，該五組設計實驗中，PLLA的質量分數達到50%時，復合支架具有更好的抗壓強度和抗變形能力。

圖4 復合支架應力-應變曲線Fig.4 Stress-strain curve of composite support

2.2 微觀形貌分析

圖5是不同質量分數的PLLA復合支架的掃描電鏡表面形貌圖。復合支架材料間的間隙大小以及間隙程度與抗壓強度抗變形能力密不可分，由掃描電鏡圖可知，當PLLA質量分數為30%時，復合支架材料表面有明顯細小松散的微孔結構且分散均勻，孔隙范圍在2～6 μm之間，復合支架材料間的結合能力較差，這可能是當PLLA的含量較少時，僅依靠HA微粒無法通過其自身黏結充分固化，形成的結構較為松散。PLLA質量分數提高至40%時，復合支架材料表面結合程度增強，微孔結構分布較為單一且材料均勻有序，表明打印過程中材料充分均勻混合。當PLLA質量分數為50%時，復合支架表面光滑，PLLA膠體與HA粉末均勻混合黏結，提高了支架的黏結強度，放大2 000倍可看到，PLLA呈膠狀附著在支架表面，與HA有效穩固地結合，交聯結構增多，支架結構的連續性更強，表現為孔徑變小，可承受更大的壓應力，材料顯示為較好的韌性和延展性，與力學實驗中分析結果相匹配。

圖5 不同質量分數的PLLA復合支架微觀形貌圖Fig.5 Microscopic morphology of PLLA composite scaffolds with different mass fraction

2.3 接觸角分析

對PLLA質量分數為30%、40%、50%三組支架分別進行接觸角測試，結果如表1所示。三組不同PLLA質量分數的差異較為明顯。接觸角測試中，材料表面的親疏水性可以由測量接觸角角度得出，測量接觸角大于90°為疏水性材料，小于90°為親水性材料。圖中看出，當PLLA質量分數為30%時，測量接觸角角度為(105.7±0.21)°，表明該質量分數下的PLLA復合支架表面為疏水性，而疏水性材料不利于回植動物體內后成骨細胞的增殖和依附。PLLA質量分數為40%和50%的復合支架表面為親水性表面，提高PLLA質量分數的含量，其測量接觸角的角度隨之降低，表現為材料具有更好的親水性，這可能是因為PLLA中含有大量OH-PLLA—COOH基團，其中羧基(—COOH)具有一定的親水性，而隨著PLLA質量分數的提高，增加了—COOH的含量，使得支架表面具有良好的親水性能。PLLA質量分數為50%時，其材料表面測量接觸角角度為(77.1±0.49)°，該配比下的復合支架親水性較其他組別有明顯提升，有利于回植動物體內后，成骨細胞的增殖、依附和蛋白質的交換。

表1 復合材料接觸角Tab.1 Contact angle of composite materials(°)

2.4 傅立葉紅外光譜分析

圖6 復合材料FTIR圖譜Fig.6 FTIR spectra of composite materials

2.5 失重率分析

復合支架體外降解實驗是可以預測支架在體內降解過程規律的一種簡易實驗。由圖7不同質量分數PLLA/HA復合支架降解率圖可以看出，相同時間內，復合支架的降解失重率隨PLLA質量分數的提升而明顯增大。復合支架降解前兩周，PLLA質量分數為30%時支架降解失重率為(0.79±0.13)%，PLLA質量分數為40%時支架降解失重率為(1.32±0.33)%，PLLA質量分數為50%時支架降解失重率為(1.48±0.88)%。隨復合支架降解至第10周，復合支架降解速率隨PLLA質量分數的提高而加快，第10周時，PLLA質量分數為30%時降解失重率為(5.04±0.53)%，PLLA質量分數為40%時降解失重率為(6.91±0.73)%，當PLLA質量分數為50%時，支架的降解失重率較第8周提高1.9倍，支架的降解失重率達到最大，為(14.22±1.23)%，這是因為體外降解主要為水解反應，而PLLA中含有大量的末端基團(羥基和羧基)，其水解斷裂速度是自由鏈斷裂速度的近十倍，隨著PLLA質量分數增大，大分子鏈水解形成小分子鏈，末端基團增多，則加快了支架的體外降解速率[13]。體外降解是體內降解的初步反映，根據降解失重率可以看出，質量分數為50%的PLLA復合支架在體外降解最快，可以有效減少新骨生成過程中，因支架應力集中而發生的偏移現象，是三組復合支架中可回植動物體內較好的選擇。圖8為復合支架降解過程中溶液的pH值，血液中穩定的pH值是維持細胞各項生命機理活動的重要指標，正常人體血液呈堿性，pH值為7.35～7.45，血液pH值過低會引起酸中毒，過高會引起堿中毒。從圖中可以看出，復合支架在前10周的降解過程中pH值大致穩定在7.2～7.5之間，PLLA質量分數為30%時，pH值波動較大。PLLA質量分數為40%和50%時，pH值相對穩定。此外，質量分數為50%的PLLA復合支架在有較大的降解速率過程中，也能維持一定pH值的穩定，沒有產生較大的pH值波動，這可能是因為復合支架中PLLA與HA是按照1∶1配比混合制備，PLLA酸性的降解產物與HA堿性的降解產物發生了中和反應，故pH值沒有明顯的變化。

圖7 不同質量分數PLLA/HA復合支架降解率Fig.7 Degradation rate of PLLA/HA composite stent with different mass fraction

圖8 pH值隨降解時間變化曲線Fig.8 pH curve with degradation time

2.6 細胞毒性實驗結果

通過CCK-8體外細胞毒性實驗驗證復合材料的安全性，將兔子成骨細胞與不同質量分數PLLA復合支架材料進行CCK-8試劑檢測并計算細胞相對增殖率。結果如圖9成骨細胞培養不同時間吸光度值顯示，隨著培養時間的增加，各組細胞的吸光度值隨之增加。其中對照組為僅含有成骨細胞、CCK-8檢測試劑而沒有支架和浸提液的吸光度值。將測得吸光度值代入式(1)求得3組復合支架5 d后的細胞相對增殖率分別為：85.8%、83.7%、82.5%。根據ISO 10993-5—2009醫療器械生物學標準評價體外細胞毒性試驗[14]，試樣的細胞相對增殖率大于70%可認為無毒，則3組復合支架材料均無毒副作用，可以進行動物體內的回植實驗，具有良好的生物安全性。

圖9 成骨細胞培養不同時間吸光度值Fig.9 The absorbance value of osteoblasts culture at different time

3 結論

本文采用擠出式3D打印技術，以PLLA和HA作為復合支架主體材料，制備出不同質量分數的PLLA/HA復合多孔支架。通過力學性能、接觸角測試、降解性能以及生物安全性實驗分析得出，復合支架的抗壓強度隨PLLA質量分數的提高而增強，當PLLA質量分數達到50%時，抗壓強度及抗變形能力達到最大。接觸角測試中顯示接觸角角度隨著PLLA質量分數的提高而減小，即增強材料表面的親水性。FTIR圖譜與SEM結合分析得出，PLLA與HA是通過物理作用結合，且支架材料之間的結合能力與PLLA質量分數成正比關系，且PLLA質量分數達到50%時，材料結合能力最大。體外降解實驗結果表明，通過3D打印制備出的PLLA/HA復合多孔骨支架的降解速率可調且與支架中PLLA的含量呈正比，50% PLLA復合支架降解速率最快，pH值較為穩定，且通過細胞毒實驗表明該組復合支架滿足生物安全性要求。下一步研究中，將50%的PLLA/HA復合支架植入生物體內，對材料內部細胞增殖黏附狀況、材料降解行為及規律進行探究。