富源酸菜源乳酸菌分離鑒定及益生特性研究

葉朋飛 劉靜 李秋達 周杰 黃杰秋 杜艷瓊

摘 要：目的：從自然發酵富源酸菜中分離乳酸菌，研究其益生特性，為乳酸菌益生菌制劑研發提供基礎數據。方法：采集自然發酵的富源酸菜樣品，使用MRS培養基分離乳酸菌，研究其耐酸、耐膽鹽、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，并采用16S rDNA基因序列分析法進行鑒定。結果：分離得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株菌株，16S rDNA序列分析結果表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分別為植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發酵乳桿菌;與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有較強的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性試驗結果顯示，戊糖乳桿菌MH-4對氯霉素、紅霉素中度敏感，德氏乳桿菌ZY-3對氯霉素敏感、對紅霉素中度敏感。結論：從富源酸菜中分離得到植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發酵乳桿菌4株乳酸菌，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有顯著耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，可作為微生態制劑候選菌株開展深層次研究。

關鍵詞：富源酸菜;乳酸菌;益生特性;抑菌活性;抗生素敏感性

Isolation， Identification and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria from Fuyuan Sauerkraut

YE Pengfei， LIU Jing， LI Qiuda ， ZHOU Jie， HUANG Jieqiu， DU Yanqiong

（Department of Modern Agriculture， Qujing Vocational and Technical College， Qujing 655000， China）

Abstract： Objective： To provide basic data for the research and development of lactic acid bacteria probiotic preparations by isolating lactic acid bacteria from natural fermented Fuyuan sauerkraut and then studying its probiotic properties. Methods： MRS medium was used to isolate suspected lactic acid bacteria from samples of Fuyuan sauerkraut to study its probiotic properties， such as acid resistance， bile resistance， antibacterial activity and antibiotic sensitivity. And? 16SrDNA sequence analysis was also applied to identify the lactic acid bacteria above. Results： Four strains， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2， were isolated. According to 16S rDNA sequence analysis， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2 were identified as Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum， respectively. Compared to the reference strain Lactobacillus rhamnosus LGG， both

L. pentosus MH-4 and L. delbrueckii ZY-3 showed greater tolerance and higher antimicrobial activity. Test results of antibiotic sensitivity showed that L. pentosus MH-4 was moderately sensitive to chloramphenicol and erythromycin， and L.delbrueckii ZY-3 was sensitive to chloramphenicol and moderately sensitive to erythromycin. Conclusion： Four LAB strains， Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum were isolated from Fuyuan sauerkraut. Among them， L. pentosus MH-4 and? L. delbrueckii ZY-3， with better performance in probiotic properties， like tolerance， antimicrobial activity and antibiotic sensitivity， were proved to be candidates for further in-depth research for microecological preparations.

Keywords： Fuyuan sauerkraut; lactic acid bacteria; probiotic properties; antibacterial activity; antibiotic sensitivity

富源酸菜是云南省富源縣農村常見的一種酸菜，以蘿卜、新鮮青菜、玉米面和水為原料，不添加其他原料，經自然發酵等工藝制成的食品[1]。富源酸菜富含膳食纖維、鈣、磷、鐵和硒等營養物質，具有健胃消食、減肥消暑、醒酒去膩等功效，因其特有的風味受到人們的喜愛。2016年12月，富源酸菜協會成功將富源酸菜和富源酸菜豬腳火鍋制作技藝申報列為曲靖市非物質文化遺產保護名錄。富源酸菜生產主要以家庭小作坊式為主，發酵過程大部分是在開放的環境中進行的，參與自然發酵的微生物種類較多。目前，關于富源酸菜有益微生物資源的分離、鑒定及相關研究尚未見文獻報道。本研究從富源酸菜中分離鑒定乳酸菌并進行益生特性研究，為挖掘、利用微生物資源，提升傳統發酵食品營養及功能品質提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樣品采自云南省富源縣傳統自然發酵酸菜。

1.1.2 指示菌和參考菌株

大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC44102、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC（B）50041、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri），上海保藏生物技術中心;鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由本實驗室保存。

1.1.3 試劑與儀器

MRS肉湯及瓊脂培養基、維生素C、石蠟油、膽鹽，索萊寶生物科技有限公司;革蘭氏染色劑，南京建成科技有限公司;厭氧產氣袋，MGC日本三菱有限公司;標準藥敏片，常德比克曼生物科技有限公司。

高壓滅菌鍋YX-18L-M，江陰濱江醫療設備有限公司;超純水儀，美國MILLIPORE公司;超低溫冰箱，ULT1386-3-V41 Thermo;渦旋混合器，江蘇海門市麒麟醫用儀器廠;微波爐M3-L236E金色，廣東美的廚房電器制造有限公司;單人單面凈化工作臺CJ-2D、生化培養箱SPX-70BⅢ，天津市泰斯特儀器有限公司;電子天平214A，上海豪晟科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

參照羅強等[2]方法，采集云南省富源縣農家天然發酵酸菜樣品，用無菌移液器吸取混合均勻的酸菜汁液快速裝入30%的無菌甘油管中，置于采樣箱中，冰浴狀態下帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

1.2.2 乳酸菌分離

將保存于30%甘油中的樣品進行10倍梯度稀釋，按1%比例接種到添加0.1%抗壞血酸的MRS肉湯中，37 ℃厭氧條件下培養24 h，富集后將培養液梯度稀釋接種于1%碳酸鈣-MRS瓊脂培養基上，37 ℃厭氧培養48 h，挑取菌落形態不同，并有明顯溶鈣圈的單菌落，純化3次后保存備用[3]。

1.2.3 乳酸菌鑒定

（1）革蘭氏染色、接觸酶試驗。將分離得到的菌株分別進行革蘭氏染色試驗、接觸酶測定試驗鑒定。

（2）分子生物學鑒定。分離得到的4株疑似菌株委托安徽通用生物科技有限公司進行16S rDNA測序，測定序列后分析比對并通過clustalX 2.0和Mega 4.0軟件構建系統發育樹對分離得到菌株進行鑒定[4]。

1.2.4 益生特性研究

（1）耐受性試驗。①酸耐受試驗。參照許強等[5]方法，接種單菌落于10 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃厭氧培養16 h，按5%比例接種到pH=2.0和pH=3.0的MRS液體培養基中，在pH=2.0的條件下孵育1 h，在pH=3.0的條件下孵育3 h，用平板計數計算乳酸菌菌落數，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。②膽鹽耐受試驗。接種單菌落于10 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃厭氧培養16 h，按5%比例接種于不同膽鹽水平（0.1%和0.3%）的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，用平板計數計算乳酸菌菌落數，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。

（2）對主要腸道致病菌的抑菌作用。參照鄒建華等[6]采用瓊脂打孔擴散法研究菌株的培養上清液（pH值調整至6.2）對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制作用，并與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG比較。

（3）抗生素敏感性試驗。參照鄒建華等[6]采用濾紙片擴散法，分析4株乳酸菌的抗生素敏感性，試驗用抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標準見表1。

1.2.5 數據分析與統計

數據用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著者進行Ducan’s多重比較，結果用平均值±標準誤表示，顯著水平設置為P=0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗結果

采用含碳酸鈣的MRS選擇性培養基從自然發酵富源酸菜中分離選出4株具有較強產酸能力的乳酸菌，編號分別為MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2。將分離得到的4株菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗，檢測結果見表2。4株菌株革蘭氏染色結果均為陽性，過氧化氫酶試驗結果均為陰性，初步判定為乳酸菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 序列的同源性分析

使用NCBI數據庫的BLAST軟件，對分離、純化后4株菌株的16S rDNA序列進行同源性比對，結果如表3所示。

由表3可知，MH-3與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的16S rDNA的相似性達99.63%，MH-4與戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）的16S rDNA的相似性達99.55%，ZY-3與德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）的16S rDNA的相似性達99.93%，YS-2與發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的16S rDNA的相似性達100.00%。

2.2.2 系統發育分析

下載與分離菌株具有較近親緣關系的模式菌株16S rDNA序列，采用鄰位相連法構建系統發育樹，結果如圖1所示。MH-3與植物乳桿菌（L. plantarum）系統位置最近，MH-4與戊糖乳桿菌（L. pentosus）系統位置最近，ZY-3與德氏乳桿菌（L. delbrueckii）系統位置最近，YS-2與發酵乳桿菌（L. fermentum）系統位置最近。綜合16S rDNA序列同源性分析和系統發育樹構建結果，MH-3鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum），MH-4鑒定為戊糖乳桿菌（L. pentosus），ZY-3鑒定為德氏乳桿菌（L. delbrueckii），YS-2鑒定為發酵乳桿菌（L. fermentum）。

2.3 益生特性研究

2.3.1 耐受性試驗

益生菌乳酸菌的重要特點是菌株應具備一定的耐酸和耐膽鹽性能，以順利通過胃酸的消化作用進入腸道發揮作用[7]。將分離、純化后的4株菌株分別在pH=3.0、pH=2.0、0.1%膽鹽、0.3%膽鹽條件下進行處理，存活率如表4所示。結果顯示，與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，MH-3、MH-4和ZY-3有較強的酸耐受性，YS-2酸耐受性較差;MH-4和ZY-3膽鹽耐受能力與參考菌株相當。

2.3.2 對主要腸道致病菌的抑菌活性

益生菌乳酸菌發揮促進腸道微生態平衡作用，關鍵益生性能是對腸道致病菌的抑菌活性。用4株菌株的培養上清液（pH值調整至6.2）研究對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制作用，結果見表5。MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌的抑制活性均顯著優于參考菌株LGG。

2.3.3 抗生素敏感性試驗

抗生素敏感性是評價益生菌安全性的重要指標之一。本研究采用濾紙片擴散法分析4株乳酸菌的抗生素敏感性。抗生素敏感性的判定參照CLSI最新版的標準進行，試驗結果見表6。MH-3、ZY-3和YS-2對氯霉素敏感，MH-4對氯霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對紅霉素中度敏感;MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2對四環素、萬古霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素和氨芐西林耐藥。

3 結論與討論

益生菌是一類攝入足夠量時對宿主機體健康有益的活性微生物的總稱[8]。大量研究證實，益生菌具有調節胃腸道微生態平衡、促進機體物質代謝、增強機體免疫功能等益生特性，其保健功能越來越受關注[9]。目前，益生菌的主要種類包括乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌等。其中，乳酸菌是最主要的益生菌種類，在世界范圍內被公認為安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）等級的食品微生物[10]。傳統發酵食品制作過程的實質是富集、馴化與培養種類各異的微生物，這些微生物代謝產生的風味物質造就了傳統發酵食品的獨特風味與豐富營養[11]。國內外已有許多研究致力于分離傳統發酵食品中具有抗菌、益生等功能的菌株。因此，從傳統發酵食品中篩選益生特性較好的乳酸菌，在改善發酵食品風味品質、開發乳酸菌微生態制劑等方面具有較好的研究價值和開發前景。

自然發酵酸菜是我國的傳統特色發酵食品，經長期的自然選擇和馴化，其中含有豐富的乳酸菌，是研究和開發有益菌群的天然寶庫[12]。許強等[5]從川西彝族酸菜汁中分離得到能耐受0.5%膽鹽濃度的環境、在pH=2和pH=3的環境中培養180 min后活菌數均大于106 CFU/mL的植物乳桿菌、副植物乳桿菌和副干酪乳桿菌。羅強等[2]從中國北方4個不同地區的20份傳統自然發酵泡菜樣品中分離得到在pH=2.0條件下處理3 h存活率在70%以上的7株乳桿菌和2株腸球菌。龔加路等[13]從川南四市收集的9份農家泡菜中分離得到1株對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌圈直徑達38.40 mm、16.50 mm，對0.3%～0.5%濃度膽鹽有良好耐受性的戊糖乳桿菌。李旭陽等[14]從寧夏銀川市采集的家庭自制的3份發酵泡菜中分離得到5株產酸較多的乳酸菌，其中瑞士乳桿菌NXU_19022的耐酸、耐膽鹽及生長性能較好，在6 h左右優先進入生長對數期，其在pH為2時的存活率約為92%，在牛膽鹽含量百分比為0.9%時的存活率約為18%。XU等[15]從中國東北酸菜中分離的干酪乳桿菌NA-2可抑制蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157：H7的生長。本研究從富源酸菜中分離得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株乳酸菌，16S rDNA序列分析表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分別為植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌和發酵乳桿菌。與參考菌株鼠李糖乳桿菌LGG相比，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3具有較強的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性試驗結果顯示，戊糖乳桿菌MH-4對氯霉素、紅霉素中度敏感，德氏乳桿菌ZY-3對氯霉素敏感、對紅霉素中度敏感。因此，戊糖乳桿菌MH-4和德氏乳桿菌ZY-3擁有良好的耐受性、抗菌活性和抗生素敏感性，可作為微生態制劑候選菌株開展深層次研究。

參考文獻

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基金項目：曲靖職業技術學院教科研課題（2020YJKT002）。

作者簡介：葉朋飛（1992—），男，云南曲靖人，碩士，助教。研究方向：農產品加工及貯藏。