淫羊藿藥材中主要黃酮類成分含量對比研究

韓 瑩

淫羊藿又稱仙靈脾等，是中醫學中常用的一味補益藥，能夠發揮補肝腎、強筋骨、祛風濕等功效。現代藥理藥效學研究已經表明，淫羊藿中所含有效成分，可以發揮調節機體免疫功能、調節血壓、延緩衰老以及改善機體微循環等作用，臨床應用較為廣泛[1-3]。在目前的藥材質量標準控制中，《中華人民共和國藥典·一部》[4]規定淫羊藿藥材主要成分包括寶藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷，而有文獻報道顯示[5-7]，淫羊藿中某些成分的含量超過了淫羊藿苷，因此本次研究收集了幾個不同品種的淫羊藿藥材，以反相高效液相色譜法(RP-HPLC)為含量測定方法，以金絲桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ這6種黃酮類成分為主要測定指標，檢測并統計分析不同淫羊藿品種中6種黃酮類成分的差異性，以期為淫羊藿藥材的質量標準制定、資源利用等方面提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 主要檢測儀器Waters高效液相色譜儀、循環真空水泵、超聲波清洗器、電子分析天平。

1.2 試藥淫羊藿苷(批號：MUST-11100145)、金絲桃苷(批號：MUST-11122003)、朝藿定A (批號：MUST-11062311)、朝藿定B (批號：MUST-11062312)、朝藿定C (批號：MUST-11062313)、寶藿苷Ⅰ(批號：MUST-11200815)，以上試藥均購自成都曼思特生物科技有限公司。5種品種淫羊藿藥材分別購自吉林臨江、貴州沿河、重慶南川、重慶巫溪、四川北川，經鑒定分別為朝鮮淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿、腺毛淫羊藿、粗毛淫羊藿的干燥地上部分。

2 方法

2.1 溶液的制備①對照品溶液的制備：精密稱取各種對照品適量，加甲醇1 ml，得到6種對照品溶液如下：金絲桃苷0.230 mg/ml、朝藿定A 0.712 mg/ml、朝藿定B 1.026 mg/ml、朝藿定C 0.470 mg/ml、淫羊藿苷0.597 mg/ml、寶藿苷Ⅰ 0.533 mg/ml。②供試品溶液的制備：取藥材粉末約0.3 g，精密稱定后置于具塞的錐形瓶中，加入25 ml稀乙醇溶液，稱定重量后超聲處理1 h，然后冷卻至室溫，再次稱定重量，用同等濃度的稀乙醇補充減失的重量，充分搖勻后過濾，取續濾液20 ml并揮干溶劑，加少量甲醇溶解后，將其轉移至2 ml的容量瓶中，稀釋至刻度，以0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2 色譜條件色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-純水(B) 梯度洗脫(0→12 min→30 min→45 min→65 min，18% A→25% A→27% A→51% A→70% A)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃。在此條件下金絲桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ均能達到基線分離。HPLC見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察分別精密量取對照品溶液各1 ml，置于10 ml容量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度并充分搖勻，即為混合對照品溶液。分別精密吸取2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl和25 μl，注入液相色譜儀測定，以進樣量為X，峰面積為Y，擬回歸方程。

2.3.2 精密度取混合對照品溶液連續進樣6次，以峰面積為指標考察儀器的精密度。

2.3.3 穩定性取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h分別進樣20 μl，測定樣品的穩定性。

2.3.4 重復性取同一批樣品6份，制備供試品溶液，測定其重復性。

2.3.5 加樣回收率精密稱取已知含量的同一批樣品6份，加入一定量的對照品，按樣品處理方法制備并進樣測定，計算各對照品的加樣回收率。

2.4 樣品含量測定照上述供試品溶液處理方法及HPLC測定條件對不同品種淫羊藿藥材進行處理和測定。

3 結果

3.1 線性關系淫羊藿中6種黃酮類成分的回歸方程及相關系數(r)分別為：金絲桃苷：Y=17.863X+3.469(r=0.999 7)，線性范圍4.6～57.5 μg/ml；朝藿定A：Y=37.546X+1.825(r=0.999 8)，線性范圍14.2～177.9 μg/ml；朝藿定B：Y=19.676X+3.026(r=0.999 8)，線性范圍20.5～256.7 μg/ml；朝藿定C:Y=26.249X+1.876(r=0.999 7)，線性范圍9.4～117.5 μg/ml；淫羊藿苷Y=23.473X+1.642(r=0.999 9)，線性范圍11.9～149.2 μg/ml；寶藿苷ⅠY=21.771X+2.596(r=0.999 8)，線性范圍10.7～133.3 μg/ml。

3.2 精密度結果顯示金絲桃苷對照品峰面積的RSD為1.54%、朝藿定A為1.89%、朝藿定B為1.78%、朝藿定C為1.25%、淫羊藿苷為1.71%、寶藿苷Ⅰ為1.08%。

3.3 穩定性結果顯示24 h內供試品溶液中金絲桃苷峰面積的RSD為1.90%、朝藿定A為1.83%、朝藿定B為1.65%、朝藿定C為1.94%、淫羊藿苷為1.62%、寶藿苷Ⅰ為1.91%。

3.4 重復性結果顯示6份樣品中金絲桃苷的平均含量為1.70 mg/g，RSD為1.75%；朝藿定A的平均含量為3.78 mg/g，RSD為1.98%；朝藿定B的平均含量為6.16 mg/g，RSD為1.51%；朝藿定C的平均含量為2.57 mg/g，RSD為2.09%；淫羊藿苷的平均含量為10.87 mg/g，RSD為2.33%；寶藿苷Ⅰ的平均含量為2.10 mg/g，RSD為1.34%。

3.5 加樣回收率結果顯示金絲桃苷的平均加樣回收率為101.25%，RSD為1.53%；朝藿定A的平均加樣回收率為98.90%，RSD為1.09%；朝藿定B平均加樣回收率為100.33%，RSD為1.96%；朝藿定C平均加樣回收率為100.46%，RSD為1.11%；淫羊藿苷平均加樣回收率為99.32%，RSD為1.64%；寶藿苷Ⅰ平均加樣回收率為99.02%，RSD為1.90%。

3.6 樣品含量測定不同品種淫羊藿藥材中6種黃酮類成分含量測定結果。見表1。

表1 不同品種淫羊藿藥材中6種黃酮類成分含量測定結果

4 討論

淫羊藿的藥用來源種類繁多，且淫羊藿藥材受產地、品種的影響，造成不同品種間的成分相差較大，史萬忠等[8]分析了不同產地、不同品種的30批市售淫羊藿藥材，發現部分藥材中的某個成分的含量并未達到《中華人民共和國藥典·一部》[4]所規定的質量標準。而裴利寬[9]研究了近10年淫羊藿藥材及飲片的質量，發現大部分箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿的淫羊藿苷和總黃酮含量均達不到標準，建議《中華人民共和國藥典·一部》從新增飲片質量標準中去除箭葉淫羊藿飲片和巫山淫羊藿飲片。有文獻報道顯示[10-12]，淫羊藿藥材中所含金絲桃苷等5種黃酮類成分的生理活性較強。因此，從淫羊藿藥材質量的整體把控考慮，應該對淫羊藿苷和其他黃酮類成分的含量共同測定，這樣有利于更好地對淫羊藿的藥材質量進行評估，更有利于合理利用藥材資源。

本研究以淫羊藿中的金絲桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ這6種黃酮類成分作為測定指標，對比分析其在不同品種淫羊藿藥材的含量差異。在對流動相的考察中，本研究對比了甲醇-純水系統和乙腈-純水系統對測定的影響，結果顯示乙腈-純水系統的分離度、峰形等色譜信息更優，故選用乙腈-純水系統作為流動相系統。此外，本研究采用梯度洗脫程序，僅僅用了4個梯度比例變化就能將6種活性成分分離。在波長選擇的考察中，中國藥典及大量文獻[13-18]報道選用波長270 nm測定淫羊藿中金絲桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ這6種成分含量，故本研究選用270 nm作為測定波長。而方法學考察結果也顯示，本次方法線性范圍較寬，精密度、重復性、穩定性、加樣回收率均符合測定標準要求，可以作為淫羊藿藥材中6種黃酮類成分的含量測定方法。

本試驗結果表明，淫羊藿藥材受品種的影響較大，6種黃酮類成分的含量在其差異較大。只有朝鮮淫羊藿、粗毛淫羊藿中的淫羊藿苷含量達到《中華人民共和國藥典·一部》規定的標準，箭葉和柔毛淫羊藿中則較低；粗毛淫羊藿、腺毛淫羊藿中朝藿定C含量明顯高于淫羊藿苷，而柔毛淫羊藿中朝藿定B含量最高。因此，以多種黃酮類成分為指標來考察淫羊藿的質量更為科學、合理。

綜上所述，本次研究中測定淫羊藿藥材中金絲桃苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ成分的方法，不僅具有操作簡便、高準確度以及良好的重復性好，而且測定時間較短，能夠為完善淫羊藿藥材的質量標準提供實驗依據。