溫度對厭氧環境中硫酸鹽還原菌所致銅鎳合金腐蝕行為的影響

宋翼，陳守剛

腐蝕與防護

溫度對厭氧環境中硫酸鹽還原菌所致銅鎳合金腐蝕行為的影響

宋翼，陳守剛

（中國海洋大學 材料科學與工程學院，山東 青島 266100）

探究環境因素（溫度）在微生物腐蝕（Microbiologically Influenced Corrosion，MIC）過程中的影響以及細菌最適宜的溫度條件，初步探索銅合金的MIC機理，為微生物的腐蝕與防護提供依據。利用生物學分析、表面分析以及電化學手段，研究不同溫度（25、37、45 ℃）條件下培養基中硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria，SRB）的生長狀況和銅鎳合金表面的腐蝕狀態，進而對微生物體系中的MIC行為進行分析。從生物學分析來看，培養周期內SRB細胞的數量先迅速增加，之后又逐漸減少。溫度為37 ℃時，檢測出的SRB細胞數和培養基中生成的H2S最多。從表面分析來看，銅鎳合金表面生成不致密的生物膜，在生物膜下面檢測出點蝕坑，且點蝕密度小。溫度為37 ℃時，生物膜覆蓋的區域最大，且該溫度下檢測到最大的平均點蝕坑深度，約9.3 μm。從電化學分析來看，在各種溫度下，浸泡在生物介質中的試樣的開路電位（OCP）大致向正方向移動，p曲線呈現先上升后下降的趨勢，溫度為37 ℃，試樣檢測出的p值最小。溫度能夠影響SRB所導致的銅鎳合金的MIC行為，且溫度為37 ℃時，SRB的生長狀態最好，銅鎳合金的腐蝕最嚴重。SRB所導致的銅鎳合金腐蝕的腐蝕機制可能是EET-MIC和M-MIC同時存在，且與銅鎳含量的差異相關。

銅鎳合金；溫度；SRB；H2S；MIC

全球腐蝕調查表明，世界平均腐蝕損失約占全球國民生產總值（GDP）的3.4%。其中，微生物腐蝕的成本占所有腐蝕損失的20%[1-5]。MIC是指微生物直接或間接地參與材料（通常是金屬）腐蝕的過程，一般是通過微生物自身的新陳代謝及其分泌產生的代謝產物來影響材料的腐蝕行為[6-8]。MIC現象早在100多年前被發現[9]。研究表明，幾乎所有的工業材料都難逃MIC的影響，其中海洋工業各種機械設備的腐蝕尤為嚴重[10-11]。

幾十年來，由于硫酸鹽廣泛分布在許多環境之中，如海水、土壤等，硫酸鹽還原菌作為MIC中代表性的厭氧微生物被廣泛研究[12-13]。微生物自身生命活動及其分泌的代謝產物，如多糖類聚合物、酶、有機酸性物質以及易揮發物質（硫化氫）等，可以通過相互影響與作用改變生物膜與金屬之間的電化學反應過程[14]。

銅鎳合金主要是以鎳元素為主要的添加元素，機械性能和耐腐蝕性能也有了明顯的提升。通常，銅合金表面會形成氧化產物膜，對基體起到了良好的保護作用。在過去的幾十年中，MIC機制取得了相當大的進展，提出了各種機制來解釋不同的MIC過程[15-16]。MIC的存在會對許多金屬材料造成腐蝕[15]。例如，MIC對碳鋼產生嚴重腐蝕的現象最為普遍[17]。Dou等人[18]研究SRB對Cu的腐蝕特性和機理，實驗發現，SRB引起的Cu的質量損失比碳鋼大近10倍。韓曉梅等人[19]發現脫硫弧菌能夠引起鋁的微生物腐蝕。

長期的研究發現溫度是影響腐蝕的關鍵環境因素。當溫度適合細菌的生長繁殖時，工程設施和設備可能會遭受更嚴重的MIC。根據SRB對溫度的要求，一般分為中溫SRB和嗜熱SRB，中溫SRB的最佳生存溫度為37 ℃，嗜熱SRB的最佳生存溫度為55 ℃[20]。溫度主要通過影響SRB的生物活性、生物膜和腐蝕產物來影響細菌對金屬的腐蝕。酶是細菌完成新陳代謝的必要條件，而酶的活性又恰恰與溫度密切相關[21-24]。

目前，Cu的MIC機理已有較為深入的研究，但與銅合金MIC相關的理論和機制還存在很多不足，環境因素對SRB所導致的銅合金腐蝕的影響需要進一步研究。因此，本文主要研究厭氧環境下不同溫度條件對SRB引起的銅鎳合金的腐蝕行為的影響，為金屬的微生物腐蝕與防護提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

銅鎳合金選取B10合金，銅基材中鎳元素的添加量約為10%。將其切割成尺寸為10 mm×10 mm×5 mm的試樣，將試樣依次用80、180、600目的砂紙在拋光機上進行研磨，只露出一個面積為1 cm2的工作表面，其他表面用惰性聚四氟乙烯涂覆。

1.2 細菌和培養基

脫硫弧菌（ATCC 7757）在ATCC 1249培養基中培養。培養基的組成為：CaSO41.0 g/L，NH4Cl 1.0 g/L，MgSO42.0 g/L，(NH4)2Fe(SO4)21.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，酵母提取物1.0 g/L，檸檬酸鈉5.0 g/L，乳酸鈉3.5 g/L。配制完培養基之后，調節培養基的pH為7左右。將實驗中所有需要滅菌的實驗材料進行121 ℃高壓滅菌。滅菌完成后，向培養基中通入高純氬氣，該過程持續60 min。在培養基中加入0.01%（質量分數）經過濾滅菌的L-半胱氨酸（除氧劑），以去除培養基中的殘余溶氧。所有需要厭氧環境的操作均在充滿氬氣氛圍的手套箱中完成。

1.3 SRB的培養

將3個B10樣塊放入每個厭氧小瓶中，加入50 ml滅菌除氧完的培養基，然后用注射器向每個厭氧小瓶注入1 ml已經提前培育好的SRB 菌液，最后用塞子和鋁蓋將瓶口密封。將厭氧小瓶放入溫度為37 ℃的恒溫恒濕箱（JYH-253，佳語，中國）中培養7 d，同時設置多組平行實驗和沒有接種細菌的對照組。7 d之后，取出培養基中的B10樣塊并對其進行分析。

1.4 SRB生長曲線測定

采用血細胞計數法對浮游細胞和固著細胞進行計數。培養7 d結束后，將樣塊取出放至磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）溶液中清洗，除去樣品表面附著的浮游細胞。用滅菌的刷子將處理好的樣品表面的生物膜剝落至10 ml的PBS溶液中，攪拌離心，使固著細胞均勻地分布在溶液中。

用熒光顯微鏡（fluorescent microscope，FM，AxioScope A1，Carl Zeiss，Jena，Germany）觀察試樣表面的活細胞和死細胞。觀察前，使用LIVE/DEAD BacLight細菌活力試劑盒（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）對試樣表面進行染色，放在暗室里15 min。

1.5 生物膜和腐蝕產物的觀察

通過掃描電子顯微鏡（SEM，Gemini300，ZEISS，Germany）觀察試樣表面的生物膜形態以及腐蝕產物分布。首先，將從培養基中取出的試樣用 PBS溶液輕輕清洗一下，放入體積分數為2.5%的戊二醛溶液中2 h固定表面的生物膜；然后，將試樣依次在體積分數為25%、50%、75%、100%的乙醇中脫水10 min；最后，將試樣放入真空干燥箱干燥。

1.6 腐蝕行為分析

用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM，Model VK- X250 K，Keyence，Osaka，Japan）來檢測樣品表面最深的點蝕坑，用10%（質量分數）H2SO4水溶液去除生物膜與腐蝕產物膜[25]，并觀察試樣表面結構。此外，用微氣相色譜儀（micro-GC，Agilent 490，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）檢測厭氧瓶頂空的H2S濃度。

1.7 電化學測試

采用電化學工作站（Reference 600+，Gamry，Philadelphia，PA，USA）進行電化學測量。線性極化電阻（LPR）以0.167 mV/s的速率在相對于開路電位的–10 mV和+10 mV之間掃描得到。電化學阻抗譜（EIS）用10 mV正弦電壓信號在穩定的OCP下，于10–2～105Hz的頻率范圍內進行測試。

2 結果和討論

圖1給出的是不同溫度條件下的培養基培養7 d后SRB的浮游細胞和固著細胞數量的變化情況。可以看出，3種不同溫度條件下，前3 d浮游細胞數都迅速增加，到第3 d達到高峰，然后浮游細胞數量逐漸減少。由于一開始營養物質和空間充足，細菌大量生長和繁殖，隨著營養物質不斷被消耗，部分細菌無法繼續生長而逐漸凋亡。此外，在7 d的培養過程中，溫度為37 ℃的培養基中的浮游細胞數和固著細胞數高于其他溫度的細胞數。

培養7 d后，不同溫度的厭氧瓶中培養的試樣上生物膜的熒光顯微鏡圖像如圖2所示。可以看出，顯示綠色的活細胞聚集在樣品表面，且幾乎看不到顯示紅色的死細胞。培養7 d后，溫度為37 ℃的培養基中的B10樣品表面固著細胞的密度比其他溫度條件下更高，這與圖1中展示的細胞計數的結果相對應。

圖3顯示了不同溫度下培養7 d后B10試樣表面生物膜和腐蝕產物的SEM圖像，可以明顯看到SRB細胞附著在B10試樣表面，并伴有生物膜和腐蝕產物的形成。溫度為25 ℃時，固著細胞和腐蝕產物比37℃和45 ℃時的少，生物膜和腐蝕產物分布不均勻。3種溫度條件下B10試樣并非完全被生物膜和腐蝕產物覆蓋。溫度為45 ℃時，試樣上的生物膜密度比37 ℃時的小。

圖1 不同溫度下在厭氧小瓶中7 d培養期間的浮游細胞計數（a）和培養7 d后B10試樣上的固著細胞計數（b）

圖2 不同溫度下培育7 d后從厭氧小瓶中取出的B10試樣上的生物膜的熒光顯微鏡圖像

圖3 不同溫度下培養7 d后從厭氧小瓶中取出的B10試樣表面生物膜表面形態和腐蝕產物的SEM圖像

在厭氧瓶中不同溫度培養7 d后，浸泡在非生物介質中的B10試樣和去除掉表面生物膜和腐蝕產物的B10試樣的CLSM圖譜如圖4所示。從圖4中可見，浸泡在非生物介質中的B10試樣并沒有發現點蝕坑，溫度為25、37、45 ℃培養的B10試樣上的最大坑深分別為5.2、9.3、7.1 μm。同時，3種溫度下的點蝕坑的密度均很小，平均點蝕坑深度分別為4.2、7.5、5.9 μm。如圖4b—d所示，相同放大倍數下，溫度為37 ℃的點蝕坑的寬度比其他溫度下的更大，說明該溫度下的點蝕最嚴重。

用微氣相色譜儀檢測出溫度為25、37、45 ℃的厭氧瓶頂空中的h2s濃度，如表1所示。通過不同溫度下H2S的亨利定律常數的計算[26]，液相中溶解的[H2S]在溫度為25、37、45 ℃時分別約為5.9×10?4、2.7×10?3、2.3×10?3mol/l。結合圖5，溫度為37 ℃時液相中溶解的[H2S]比其他溫度多。SRB在溫度為25、37、45 ℃的條件下培養7 d后，溶液中的pH值分別為6.81、7.12、7.09（圖5）。很明顯，所有的pH值都接近中性，37 ℃下的pH值略高。對比培養基的初始pH和實驗結束后的pH，均處于中性，這也排除了培養過程中H+腐蝕的可能性。

圖6顯示了在溫度為37 ℃的厭氧瓶中浸泡在非生物介質中的B10試樣和在不同溫度（25、37、45 ℃）的厭氧瓶中浸泡在生物介質中的B10試樣在7 d培養期間的開路電位（OCP）。由于不同溫度下浸泡在非生物介質中的B10試樣的OCP差別不大，只選取了一種溫度條件繪制圖像。在7 d的培養過程中，非生物對照試樣的OCP值保持在?280 mV，波動不大。而在不同溫度下培育的試樣的OCP值遠低于非生物系統。3種溫度對應的OCP在7 d培養期間均向正方向移動，且37 ℃相比于其他溫度條件下OCP所處的電位更負，說明該溫度下的腐蝕熱力學趨勢更嚴重。

圖6b顯示了在溫度為37 ℃的厭氧瓶中浸泡在非生物介質中的B10試樣和在不同溫度（25、37、45 ℃）的厭氧瓶中浸泡在生物介質中的B10試樣在7 d培養期間的線性極化電阻p。同樣，不同溫度下浸泡在非生物介質中的B10試樣的p差別不大，只選取了一種溫度條件繪制圖像。從圖中可以看出，非生物對照試樣的p值在整個培養時間內保持穩定，遠高于生物組試樣的p值。p代表腐蝕動力學趨勢，溫度為37 ℃時，試樣的p最低，對應的腐蝕速率最高。

圖4 不同溫度下的厭氧小瓶中培育7 d后厭氧小瓶中的B10試樣表面輪廓及去除生物膜和腐蝕產物后表面的CLSM圖像

表1 不同溫度下培育7 d后含有B10試樣和SRB培養基的厭氧小瓶中頂空中的H2S濃度及液相中溶解的H2S濃度

Tab.1 H2S concentration in headspace and dissolved H2S concentration in liquid phase in anaerobic vials in anaerobic vials containing B10 specimens and SRB medium after the 7-day incubation under different temperature (25 ℃, 37 ℃ and 45 ℃)

圖5 不同溫度下在厭氧小瓶中培育7 d后液相中溶解的H2S濃度及pH值

圖6 浸在37 ℃的非生物體系的厭氧小瓶和浸在不同溫度下的SRB培養基中B10試樣培養7 d期間的OCP（a）和線性極化電阻（Rp）（b）

值得注意的是，在各種溫度下，B10樣品的p曲線都是先上升后下降，說明B10樣品的腐蝕速率先下降后上升。對于前3 d，是由生物膜的形成造成的。生物膜中含有的EPS是一種不良導體，其在樣品表面積累導致Cu基底與培養基之間的實際接觸面積減小，電子傳遞速度減慢。3 d后，SRB的生長達到高峰，產生了大量的H2S，高濃度溶解的H2S對樣品成分中Cu的氧化反應在動力學上是有利的。因此，雖然生物膜不斷積累，但腐蝕速度仍在增加。另一方面，疏松多孔的生物膜為SRB提供了一個完美的藏身之處，阻礙了HS–從膜內向溶液擴散，導致HS–濃度較高，增加了腐蝕速率并造成局部區域點蝕的發生。

圖7顯示了溫度為37 ℃的厭氧瓶中浸泡在非生物介質中的B10試樣和不同溫度下的厭氧瓶中浸泡在生物介質中的B10試樣的動電位極化掃描曲線（Tafel曲線）。由于不同溫度下浸泡在非生物介質中的B10試樣的Tafel曲線差別不大，只選取了一種溫度條件繪制圖像。圖中可以清楚地看到在3種溫度下生物系統中B10 樣品的陽極極化曲線的鈍化區域，說明B10樣品在SRB的作用下發生鈍化。如表2所示，37 ℃下接種的B10樣品的腐蝕電流密度（corr）最大，25 ℃下接種的B10樣品的corr最小，說明溫度為37 ℃下接種的B10樣品的腐蝕速率比其他兩個溫度的快。

圖7 浸在37 ℃的非生物體系的厭氧小瓶中和浸在不同溫度下的SRB培養基中的B10試樣培養7 d結束時的動電位極化曲線（非生物體系試樣在25 ℃和45 ℃培育下的動電位極化曲線與37 ℃相近）

結合不同溫度下的生物表征、表面分析和電化學分析等實驗結果可以看出，3種溫度下銅鎳合金的微生物腐蝕機理相同。溫度是影響腐蝕的關鍵環境因素，溫度主要通過影響SRB的生物活性、生物膜和腐蝕產物來影響細菌對金屬的腐蝕。所以溫度本身對腐蝕機理沒有影響，其變化會對金屬的腐蝕程度造成影響。

表2 浸在37 ℃的非生物體系和浸在不同溫度下的SRB培養基中的B10試樣培養7 d結束時極化曲線擬合的電化學參數

Tab.2 The electrochemical parameters of polarization curve fitting at the end of 7 days of culture of B10 samples immersed in abiotic system at 37 ℃ and SRB medium at different temperatures (25 ℃, 37 ℃ and 45 ℃)

在自然環境中，SRB常從有機碳源（如乳酸）作為電子供體獲得能量進行自身的呼吸作用。同時，硫酸鹽作為末端電子受體[6,27]。反應式（1）—（4）合理地解釋了生物催化陰極硫酸鹽還原（Biocatalytic Cathodic Sulfate Reduction，BCSR）理論[6]。

研究表明，Fe可以作為電子供體為SRB提供能量[28]，而Cu不能作為電子供體[29]。銅鎳合金主要是在銅基材里添加鎳元素以及其他微量的金屬元素。計算Ni的還原電勢用到的能斯特方程式為：

顯然，在25 ℃、1 mol/l溶質（0.1 mpa氣體）、pH值為7的條件下，Ni的氧化與硫酸根的還原的耦合電勢為cell=+40 mV，這意味著SRB所導致的鎳腐蝕在熱力學中是有利的，即SRB可以通過胞外電子傳遞型微生物腐蝕（Extracellular Electron Transfer MIC，EET-MIC）從Ni中獲得能量。因此，SRB所導致的銅鎳合金的MIC機制可能是EET-MIC和代謝產物型微生物腐蝕（Metabolite MIC，M-MIC）同時存在，所以SRB所導致的銅鎳合金腐蝕的腐蝕機理有以下幾種情況：（1）兩種腐蝕機理同時存在，可能對某種金屬的腐蝕會占主導或兩者相當；（2）只發生其中一種MIC，這與銅鎳含量的差異相關。

3 結論

1）溫度能夠影響SRB所導致的銅鎳合金的MIC行為，且溫度為37 ℃時，SRB的生長狀態最好，銅鎳合金的腐蝕最嚴重。腐蝕性代謝產物H2S的濃度對點蝕的產生至關重要。

2）SRB所導致的銅鎳合金腐蝕的腐蝕機制可能是EET-MIC和M-MIC同時存在，對某種金屬的腐蝕會占主導或兩者相當，這可能與銅鎳含量的差異相關。SRB所導致的銅鎳合金腐蝕的腐蝕機理仍需進一步研究。

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Effect of Temperature on Corrosion Behavior of Copper-nickel Alloys by Sulphate-reducing Bacteria in Anaerobic Environment

,

(School of Materials Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

This paper aims to investigate the influence of environmental factors (temperature) in the process of microbio-logically influenced corrosion (MIC), the optimum temperature conditions for bacteria and a preliminary exploration of the MIC mechanism of copper alloys to provide a basis for microbial corrosion and protection. The growth of sulphate-reducing bacteria (SRB) and the corrosion state of copper-nickel surfaces in the medium at different temperatures (25 ℃, 37 ℃ and 45 ℃) were investigated by means of biological analysis, surface analysis and electrochemical testing techniques. Results revealed that the number of SRB cells first increased rapidly during the incubation period and then decreased gradually. The highest number of SRB cells detected and the highest amount of H2S generated in the culture medium were found at 37 ℃. An undense biofilm was generated on the surface of the copper-nickel alloy and pitting pits were detected beneath the biofilm with a small pitting density. The area covered by the biofilm was greatest at 37 ℃ and the greatest average pitting pit depth, approximately 9.3 μm, was detected at this temperature. At all temperatures, the OCP of specimens immersed in biological media moved in a generally positive direction, with the linear polarization resistance (p) curve showing a tendency to rise and then fall. At 37 ℃,pvalues detected for specimens were the smallest. The conclusions are drawn from the analysis of the results. Temperature is able to influence the MIC behaviour of copper-nickel alloys caused by SRB. The best growth of SRB and the most severe corrosion of copper-nickel alloys occurs at 37 ℃. The corrosion mechanism of copper-nickel alloys caused by SRB may be both EET-MIC and M-MIC, which may be related to the difference in copper-nickel content.

copper-nickel alloys; temperature; SRB; H2S; MIC

2021-05-09；

2021-05-28

SONG Yi (1995—), Male, Postgraduate, Research focus: microbiologically influenced corrosion.

陳守剛（1974—），男，博士，教授，主要研究方向為腐蝕與防護。

CHEN Shou-gang (1974—), Male, Ph. D., Professor, Research focus: corrosion and protection.

宋翼, 陳守剛. 溫度對厭氧環境中硫酸鹽還原菌所致銅鎳合金腐蝕行為的影響[J]. 表面技術, 2022, 51(3): 95-102.

Tg172

A

1001-3660(2022)03-0095-08

10.16490/j.cnki.issn.1001-3660.2022.03.009

2021-05-09；

2021-05-28

國家自然科學基金（42006042，51572249）

Fund：Supported by the National Natural Science Foundation of China (42006042, 51572249)

宋翼（1995—），男，碩士研究生，主要研究方向為微生物腐蝕。

SONG Yi, CHEN Shou-gang. Effect of Temperature on Corrosion Behavior of Copper-nickel Alloys by Sulphate-reducing Bacteria in Anaerobic Environment[J]. Surface Technology, 2022, 51(3): 95-102.