基于環介導等溫擴增的離心式微流控芯片檢測3種致病菌

姚延祿,曹寧,周新麗

(上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海,200093)

食品安全引起的疾病影響人類健康和生命,會造成巨大經濟損失[1]。其中最為常見的食源性致病菌為大腸桿菌、單增李斯特氏菌和沙門氏菌。根據《世界衛生報告》,全世界每年約有1/10的人因食物污染而生病,每年約有180萬人因食源性疾病而死亡[2]。目前已有多種食源性致病菌的檢測方法,廣泛應用的有傳統菌落分離的培養方法、免疫學方法和分子生物學法等。其中,分子生物學檢測方法中的環介導等溫擴增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技術僅需要一個恒溫平臺,便能將樣品進行高效、快速的核酸擴增反應,達到檢測數量[3],具有檢測時間短、靈敏性高和檢測結果準確等優勢。但由于預處理時間長,需要專業的檢測人員操作,不易在現場及基層推廣。

微流控技術是將傳統實驗室的基本功能整合到僅有幾平方厘米的芯片上,僅通過pL或μL體積的微量流體,便能實現生化分析的各個步驟。此方法具有微型化、集成化、高通量、自動化的優勢,為實現現場檢測、低成本的生化分析提供了經濟簡便的檢測技術途徑。目前微流控檢測芯片已廣泛應用于血液檢測[4]、藥物篩選[5]、核酸分析[6]、水質分析[7]及食品檢測[8]等方面。

LAMP與微流控技術相結合,使病原菌檢測更加快速、便捷。DOU等[9]使用聚二甲基硅氧烷與紙基結合的微型設備在LAMP反應后,使用便攜式紫外線筆燈照射LAMP產物,可快速檢測腦膜炎奈瑟氏球菌。此設備雖然成本較低,但是并不能實現高通量以及多樣本的檢測,而且在檢測一些需要繁瑣的DNA分離和純化程序時,就顯得尤為不足。LUO等[10]研發出的一種微流控多重電化學LAMP芯片,檢測精度高,但是分析末端電信號的電化學檢測器價格貴,且不具備高通量樣品檢測的能力。LIU等[11]研發出具有完全集成化的LAMP分析高通量液滴微流體系統,使用液滴技術結合磁珠在聚四氟乙烯毛細管進行結核分枝桿菌的檢測。可同時處理多個樣品耗時短臨床敏感性特異性高,但此微流體平臺需要外部設備微流體泵來控制液體流量,并需要輔助檢測器進行擴增檢測。

綜上,需要外部設備來控制液體、檢測器價格高、高通量樣品檢測能力是制約微流控技術用于食源性致病菌快速現場檢測的原因。離心式微流控芯片能夠通過離心力沿微流體通道泵送液體,無需復雜流體驅動設備,僅需使用普通的電機便能實現微流體的驅動,逐漸受到關注。顯色結果將通過智能手機進行數據采集及計算,方便快捷適用于現場檢測[12]。

本文基于LAMP設計制作出一種離心式微流控芯片,用于大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌的3種食源性致病菌的快速可視化檢測。首先,建立芯片上的LAMP反應體系并對反應條件進行優化,其次,通過離心式微流控平臺實現食源性致病菌多樣本、多指標的核酸等溫擴增及可視化檢測,最后對基于LAMP的離心式微流控芯片法檢測多種食源性致病菌的特異性及靈敏性進行確認。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：光學級聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)板材,日本三菱；光學級雙面膠,東莞富印膠粘科技有限公司；營養瓊脂培養基,青島海博；LB肉湯培養基,上海博微；DP705磁珠提取試劑盒,天根生化科技有限公司；B600001 Taq DNA聚合酶,上海生工。

菌株：大腸桿菌(ATCC 43895)、單增李斯特氏菌(ATCC 19117)，北京生物保藏中心；甲型副傷寒沙門氏菌(IQCC 10518)，上海保藏生物技術中心。

1.2 儀器與設備

VLS2.30二氧化碳激光雕刻機,美國UNIVERSAL；TBK508芯片貼合機,深圳市深旺達科技有限公司；YQ-620C超聲波清洗機,上海易凈超聲波儀器有限公司；DW-86L828型超低溫保存箱,青島海爾科技有限公司；HD850超凈臺,江蘇杰森博生物科技有限公司；GHP-9160恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司；ST16低溫離心機,北京賽默飛科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測原理

采用LAMP作為食源性致病菌的檢測方法,使用羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue,HNB)作為芯片上LAMP反應的金屬離子指示劑,HNB在高濃度的 Mg2+中呈現紫羅蘭色；隨著LAMP反應的進行,Mg2+濃度降低,失去Mg2+的HNB變成天藍色,而陰性對照仍為紫羅蘭色,陰性和陽性結果差異明顯[13]。

基本檢測過程：將3種不同致病菌的引物預存儲在芯片上,再將芯片放置在自制的恒溫離心式微流控平臺上;使用移液槍添加樣品緩沖液,通過再調節不同的離心速度,使樣品進入檢測腔進行等溫擴增,發生顯色反應;用手機放在固定光源固定高度的拍攝點進行拍照,對顯色溶液進行RGB值對比。

1.3.2 芯片的設計與制作

芯片材質均為PMMA,由蓋板、通道層、池體層及底板4層組成,厚度分別為0.5、0.8、2.1及0.5 mm,其三維結構如圖1-a所示。蓋板層主要包括進樣孔及通氣孔；通道層主要包括進樣腔、等分腔、廢液腔、檢測腔(1a,1b,1c,1d)、毛細管閥等結構；池體層主要包括進樣腔、等分腔、廢液腔、檢測腔(1a,1b,1c,1d)、微通道等結構組成,各腔室具有固定的體積,分別為100、25、25及25 μL,如圖1-b所示。與底板進行密封鍵合,鍵合完成后芯片實物如圖1-c所示,芯片由5個相同的單元組成,能夠同時執行20個獨立的反應。芯片設計5 °的偏心結構,目的是使流體流入4個相同的等分腔進行等分,并將多余樣品流入到廢液腔內。

a-離心式微流控芯片三維結構;b-反應單元結構示意圖;c-離心式微流控芯片實物圖

芯片制作采用二氧化碳激光雕刻法。采用Solidworks軟件設計出芯片的三維立體結構圖,并將立體結構分成3層平面圖,包括頂層、通道層及底層；將各層的結構圖形傳輸至激光雕刻機,進行平面加工,選擇向量打印參數分別為：功率60 W,速度20 s,PPI 1000進行雕刻,得到二維的PMMA芯片；將雕刻完成的微流控芯片放入等離子超聲波清洗器中清洗3次,功率100 W,清洗15 min,放入烘箱中烘干30 min；將烘干后的芯片模型置于真空貼合機中,設置鍵合參數為真空度100 kPa、鍵合壓力4.2 kg/cm2、鍵合時間10 min,將3層結構對齊后進行壓裝；將芯片結構放入除泡室中,設置除泡壓力為7.5 kg/cm2、除泡10 min,即獲得最終芯片。

1.3.3 實驗平臺的搭建

為實現離心式微流控芯片上的流體控制、等溫擴增及檢測功能,設計并制作出一套離心式微流控核酸等溫擴增裝置,總體結構如圖2所示。該裝置主要由3個模塊組成,分別為離心模塊、加熱模塊及手機成像檢測模塊。該裝置能夠搭載不同設計原理的離心式微流控芯片,可實現轉速控制離心、溫度控制、可視化檢測,具有較好的便攜性和集成性。平均溫度誤差范圍在±1 ℃,電機轉速從低速向高速的過程中,誤差能夠控制在±10 r/min,微流控芯片中的試劑可以順利通過設計的微通道,實現等溫核酸擴增及檢測。

圖2 離心式微流控核酸等溫擴增裝置示意圖

1.3.4 離心式芯片的流體流動過程

在芯片鍵合之前,將4 μL的引物加入到每個反應腔中,并在低溫冷凍干燥箱中干燥約40 min。在芯片使用前,進樣孔及通氣孔均用硅膠膜密封,以避免樣品污染。從進樣孔添加定量樣品及LAMP緩沖液于進樣腔內,再將離心式芯片固定到離心系統的旋轉電機的芯軸上。調節轉速,旋轉方向為逆時針、旋轉時間為15 s,測試流體分布的1次、2次離心速度。設定旋轉速度從0 r/min開始,每增加100 r/min測試1次,當離心速度能將樣品及緩沖液等分到偏心結構的4個獨立腔體,并將多余樣品流入到廢液腔內,得到1次離心速度。當毛細管閥引起的毛細管力無法承受離心壓力時,樣品通過毛細管閥進入反應腔,得到2次離心速度。最終,當被檢測樣品進入檢測腔后,使用硅膠密封貼將進樣孔及通氣孔密封,以防止液體蒸發形成氣溶膠污染。

1.3.5 芯片上LAMP反應體系的建立

采用New England Biolabs試劑盒,配合大腸桿菌、單增李斯特氏菌及甲型副傷寒沙門氏菌等菌種的特異性引物進行核酸擴增,驗證所建立芯片上LAMP反應體系的可行性。將提取的模板DNA作為質量分數為100%的源性成分DNA。LAMP反應試劑盒體系：10×ThermoPol 緩沖液、6 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTP premix、1.6 μmol/L FIP/BIP、0.2 μmol/L F3/B3、40 U Bst DNA聚合酶、1 μL DNA模板及200 μmol/L的HNB溶液。

使用Primer Explorer V4軟件(http://www.primerexplorer.jp/e/)為每種目標食源性致病菌設計了4種LAMP引物。有學者設計了4條特異性引物用于LAMP,包括2條內引物(FIP/BIP),2條外引物(F3/B3)[14-15],大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌及沙門氏菌的LAMP引物分別如表1～表3所示。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。

表1 大腸桿菌的LAMP引物

表2 單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物

表3 沙門氏菌的LAMP引物

1.3.6 芯片上LAMP實驗條件的優化

為了進一步優化芯片上的可視化檢測體系,采用上述芯片對濃度為1×109CFU/mL大腸桿菌菌懸液提取核酸作為模板。芯片上LAMP反應試驗溫度選擇65 ℃恒溫60 min,選取終濃度為4、6、8、10 mmol/L的Mg2+緩沖液進行實驗,探索對Mg2+濃度LAMP的影響；選用HNB濃度為120、150和200 μmol/L的HNB溶液進行試驗,挑選顯色反應可視化最明顯的反應參數。

1.3.7 圖像處理

為了提高顏色分析的可靠性,將不同引物下反應腔的顏色變化的結果,用基于RGB的圖像處理方法進行表征。將手機拍攝的顯色區域的圖片導入Image J軟件中,隨機選取3個20×20的像素點,分析R、G、B 3個通道的直方圖,分別記錄R、G、B值,最后計算3個像素點R、G、B平均值。

使用RGB圖像處理的方法對檢測結果的顏色變化進行定量分析,計算出45個陰性反應G/R的平均比率為0.91,180個陽性反應G/R的平均比率為1.233,因此G/R陰性與陽性之差為0.323；計算出B/R的45個陰性反應的平均比率為1.44,180個陽性反應的平均比率為1.75,因此B/R陰性與陽性之差為0.31；計算出G/B的30個陰性反應的平均比率為0.67,180個陽性反應的平均比率為0.71,因此G/B陰性與陽性之差為0.04。從陽性和陰性反應之差的數值來看,G/R和B/R大于G/B,因此選取使用G/R和B/R值作為區分陰性陽性的標準。

1.3.8 芯片上檢測多種食源性致病菌的特異性

在芯片的3個單元進行檢測,圖1-b中檢測腔1a～1c分別預存儲大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌的引物,1d為冷凍干燥ddH2O陰性對照組。在1、2、3單元中分別添加僅含有大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌的核酸緩沖液；按照1.3.5所述反應體系,進行LAMP擴增,驗證一塊芯片上同時分別檢測3種病原菌的可能性。

在芯片的4個單元進行檢測。將3種菌種的核酸緩沖液兩兩混合得到的3種混合核酸緩沖液分別添加至芯片的前3個單元中,4單元中添加含有3種菌的混合核酸緩沖液,按照1.3.5所述反應體系,在離心式微流控芯片上進行LAMP擴增,驗證是否能夠準確檢測出多種病原菌,即微流控芯片檢測是否具有特異性。

1.3.9 芯片上3種食源性致病菌的敏感性

在兩塊芯片的9個反應單元對3種食源性致病菌的敏感性進行測試。用上述3種食源性致病菌的核酸混合液,按照10倍濃度梯度進行稀釋,得到10～109copies/μL,加入到9個反應單元的進樣腔中,根據顯色結果,分析不同食源性致病菌核酸的檢測限。

2 結果與分析

2.1 離心式芯片的流體流動過程驗證結果

離心式微流控芯片中液體流動過程如圖3所示,離心式微流控芯片的加樣狀態如圖3-a所示,將LAMP試劑及DNA樣品加載到離心式微流控芯片中。

a-加樣狀態；b-低速離心狀態；c-高速離心狀態

在300 r/min下,LAMP試劑開始流入偏心等分通道中進行等分。在900 r/min時候,低速離心狀態如圖3-b所示,溶液充滿等分腔,多余液體流入廢液腔。在速度調節至2 300 r/min時候,高速離心狀態如圖3-c所示,毛細管閥被激活,等分完成后LAMP試劑進入檢測腔與引物混合,開始DNA擴增。在DNA擴增之前,使用硅膠膜進行密封,以防止等溫擴增過程中液體蒸發、損失及氣溶膠性污染。

2.2 芯片上LAMP實驗條件的優化結果

當Mg2+終濃度為4、6、8、10 mmol/L時,大腸桿菌完成LAMP反應后的顯色結果,如圖4所示。由圖可以看出,在Mg2+終濃度8 mmol/L時,藍色和紫色的區分程度最高,因此選取實驗所用Mg2+濃度為8 mmol/L。

a-4 mmol/L；b-6 mmol/L；c-8 mmol/L；d-10 mmol/L

當HNB濃度為120、150和200 μmol/L時,大腸桿菌完成LAMP反應后的顯色結果,如圖5所示。由圖可以看出,在HNB濃度為200 μmol/L時,藍色和紫色的區分程度最高,因此選取實驗所用HNB濃度為200 μmol/L。

a-120μmol/L；b-150μmol/L；c-200μmol/L

2.3 芯片上多種食源性致病菌的特異性檢測

為了證明離心式微流控芯片能夠同時進行多種食源性致病菌的檢測,采用大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌進行LAMP反應,進行多重檢測。

在圖6-a中1單元中添加僅含有大腸桿菌核酸緩沖液,1a中顏色由紫羅蘭色變為藍色,其他區域均無顏色變化；在圖6-a中2單元中添加僅含有單增李斯特氏菌核酸緩沖液,結果顯示,僅1b發生顏色變化,其他區域均無顏色變化；在圖6-a中3單元中添加僅含有沙門氏菌核酸緩沖液,結果顯示,僅1c發生顏色變化,其他區域均無顏色變化。結果表明該芯片能夠檢測出單一菌株。

在圖6-b中1單元添加含有大腸桿菌及單增李斯特氏菌的混合核酸緩沖液,僅1a與1b發生由顏色變化,其他區域均無顏色變化；圖6-b中2單元添加含有大腸桿菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,僅1a與1c發生顏色變化,其他區域均無顏色變化；圖6-b中3單元添加含有單增李斯特氏菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,僅1b與1c發生顏色變化,其他區域均無顏色變化；圖6-b中4單元添加含有大腸桿菌、單增李斯特氏菌及沙門氏菌的混合核酸緩沖液,在1a～1c區域發生顏色變化,陰性對照組無顏色變化。綜上所述,3組引物均對靶細胞具有特異性,并且沒有發生引物混合物溶液和所得DNA擴增子的蒸發而產生污染問題,證明可以在單個離心式微流控芯片上進行3種食源性致病菌的檢測。

a-一種食源性致病菌的檢測；b-多種食源性致病菌的檢測；c-一種食源性致病菌G/R與B/R的關系；d-多種食源性致病菌G/R與B/R的關系

最終對可視化數據進行RGB圖像處理的方法進行數據分析,結果如圖6-c、圖6-d所示。從1種食源性致病菌G/R與B/R的關系可以看出,1a,2b,3c可以確定為陽性反應結果,其余為陰性反應結果。從芯片上有多種食源性致病菌G/R與B/R的關系可以看出,1單元1a,1b為陽性,2單元2a、2c為陽性,3單元3b、3c為陽性,4單元4a、4b、4c均為陽性。此結果與可視化結果相同,說明能夠用G/R和B/R的數值能夠有效區分陰性和陽性,離心式微流控芯片方法可以進行3種食源性致病菌的同時檢測,且特異性良好。

2.4 芯片上3種食源性致病菌的敏感性實驗結果

將3種濃度為10～109copies/μL食源性致病菌的核酸混合液分別加入9個反應單元的進樣腔,在離心式微流控芯片上進行LAMP擴增后結果如圖7所示。圖7-a中在1～5區域中均有顏色變化,陰性對照組無顏色變化。圖7-b中在1～2區域中發生顏色變化,陰性對照組無顏色變化。在3～4區域中1a、1b及1c區域及陰性對照組均無顏色變化。當濃度≤102copies/μL時,不能檢測出來,離心式芯片上3種食源性致病菌的檢測限為103copies/μL。

通過RGB圖像處理的方法進行驗證,圖7-c～圖7-e分別表示大腸桿菌、單增李斯特氏菌及沙門氏菌G/R與B/R的關系,當3種菌的濃度為102和10 copies/μL時,檢測結果都出現在陰性區,3種菌的濃度≥103copies/μL時,檢測結果都出現在陽性區,說明3種食源性致病菌的檢測限為103copies/μL。RGB圖像處理結果與可視化結果相同,這表明用G/R和B/R的數值區分陰性和陽性結果具有較高的準確率。

a-濃度為105-109 copies/μL的敏感性檢測;b-濃度為10～104 copies/μL的敏感性檢測;c-大腸桿菌G/R與B/R的關系;d-單增李斯特氏菌的G/R與B/R的關系;e-沙門氏菌的G/R與B/R的關系

2.5 方法對比

將本文提出的離心式微流控LAMP等溫擴增方法與已報道的LAMP擴增方法進行對比。呂觀等[16]建立了金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7的實時熒光LAMP檢測方法。通過配制完整的LAMP反應體系,對目標質粒進行擴增反應,在熒光定量 PCR儀上設置反應程序為：65 ℃預變性30 s；65 ℃,15 s,65 ℃;45 s,45個循環進行擴增,然后取25 μL反應產物和5 μL 6×載樣緩沖液混合后2%凝膠電泳檢測,測得沙門氏菌質粒的靈敏度為1.91×102copies/μL,金黃色葡萄球菌質粒的靈敏度為2.72×102copies/μL,大腸桿菌O157∶H7的質粒靈敏度為2.28×102copies/μL。此方法使用EP管在PCR儀中進行恒溫擴增,凝膠成像系統對擴增產物進行檢測,整個檢測過程耗時長,操作步驟繁多,不便于現場檢測。LUO等[10]研發出一種微流控多重電化學LAMP芯片,將芯片置于智能恒溫加熱板上在63 ℃下進行擴增,通過數字光纖耦合的光學傳感器系統進行電化學檢測鑒定結核分枝桿菌、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌,檢測限分別為28、17、16 copies/μL。此檢測方法靈敏度很高,但需要昂貴的檢測設備,不便于推廣。上述研究中的檢測過程都需要專門的檢測設備,包括凝膠成像系統、光學傳感器等。本文提出的離心式微流控LAMP等溫擴增體系在檢測靈敏度方面還有一定的提升空間,但此方法通過離心力沿微流體通道泵送液體,不需要復雜流體驅動設備,僅需使用普通的電機便能實現微流體的驅動；其次,整個檢測過程不需要專門的檢測設備,將顯色結果通過智能手機進行數據采集及計算,區分陽性反應和陰性反應,實驗條件更加方便,適用于現場檢測；此外,可以同時進行5種樣品的3種食源性致病菌的檢測,大大提高了檢測的通量。離心式微流控芯片法與ELISA法及實時熒光定量PCR法相比較,反應條件簡單僅需恒定溫度,便能快速擴增目的基因,敏感性與實時熒光定量PCR法相當,且基于LAMP的離心式微流控芯片具有反應時間短,試劑消耗量少,易于集成等優勢,具有實現核酸提取、擴增、檢測集成化、自動化的發展潛力。

3 結論

本文基于LAMP技術檢測原理,設計了離心式微流控檢測芯片,并通過對LAMP實驗中的Mg2+濃度以及HNB濃度進行優化,使得可視化檢測結果更加明顯。實驗結果表明,在900 r/min轉速下,微流控芯片中溶液充滿等分腔,多余液體流入廢液腔,在2 300 r/min轉速下,毛細管閥被激活,LAMP試劑進入檢測腔與引物混合,進行核酸擴增。用羥基酚藍染料作為指示劑,通過肉眼觀察芯片上的顏色變化從紫羅蘭色到天藍色,結合LAMP反應的結果,使用RGB的數據處理與可視化結果進行對比,能夠更加準確的區分陽性反應和陰性反應。采用離心式微流控檢測芯片對大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特氏菌進行檢測,能夠在60 min內完成,并且該芯片具有良好的特異性及敏感性,檢測限為103copies/μL。本研究還存在一定的局限性,如未考慮實際食源性致病菌檢測的食品基質,且通過顯色反應得出的檢測結果精度還不夠高,僅在現場快速檢測的半定量分析。后續研究還可以將核酸提取及核酸擴增集成到一張芯片上,達到核酸提取、擴增、檢測的集成化、自動化。