美拉德反應改良羅非魚加工副產物熬煮液風味

邢貴鵬,孫申宇,2,黃卉*,魏涯,李來好,楊賢慶,郝淑賢,岑劍偉,趙永強,陳勝軍,林織

1(中國水產科學研究院 南海水產研究所,國家水產品加工技術研發中心,農業部水產品加工重點實驗室,廣東省漁業生態環境重點實驗室,廣東 廣州,510300)2(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)3(廣東順欣海洋漁業集團有限公司,廣東 陽江,529800)

近年來水產養殖業蓬勃發展,養殖魚類已成為全球食用魚類的主要來源,羅非魚是重要的世界性養殖魚類之一[1],我國是全球主要的凍羅非魚生產國[2],每年產生的加工副產物占原料魚總量40%～60%[3-4],其合理利用的問題日益突出。對副產物進行高值化利用,開發多元產品,是羅非魚產業的重要發展方向。

目前利用魚副產物制備風味型營養食品已成為國際研究熱點之一,水產調味料在保留一部分天然風味的同時富含蛋白質、礦物質以及維生素,應用前景廣闊。羅非魚加工副產物中的必需氨基酸占氨基酸總量的57.3%,組成模式符合FAO/WHO推薦的理想模式,是優良的水產調味料加工來源[5-6]。但水產調味料往往面臨著風味較為單一的問題,制約著相關產品的發展。

美拉德(Maillard)反應是一種羰氨縮合的非酶褐變反應,是改善或增強食品風味的重要途徑,主要是以還原糖類為主的羰基化合物和以氨基酸和蛋白質為主要類型的氨基化合物之間的復雜反應[7],一系列反應會生成包括不揮發性的香味物質前驅物,揮發性香味物質以及類黑精褐色含氮色素等復雜產物,賦予產品獨特的風味和色澤[8-9]。馮婷婷等[10]采用木糖與雜色蛤蒸煮液混合進行美拉德反應,制備出一種天然海鮮調味料；王茵等[11]選用花蛤蒸煮液與木糖進行美拉德反應,得到的產物在色澤、香氣上要優于使用葡萄糖、核糖。

本研究以羅非魚熬煮液為原料,以美拉德反應的中間產物、褐變程度以及感官評分為指標,考察木糖添加量、反應時間、反應溫度以及初始pH值對美拉德反應的影響,優化了美拉德增香工藝,并評價產物的氨基酸成分、揮發性成分、感官評定指標,以期為羅非魚加工副產物高值化利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚購自國聯水產,去除腮、內臟、尾、鰭及腹內黑膜,洗凈取下魚片后于-18 ℃保存；紫蘇脫腥液(100%純度),浙江世紫生物科技有限公司；海天牌食用白醋,廣州市海珠區客村華潤萬家；香芹液,市售小香芹以質量比1∶2與蒸餾水榨汁破碎,浸泡30 min,沸水浴浸提30 min,趁熱使用400目濾布過濾后稀釋成70%的溶液；木糖、Na2HPO4(均為食品級),河南明瑞食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-S-3L恒溫數顯油浴鍋,江蘇科析儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計、GCMS-Qp2010島津氣質聯用儀,日本島津公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器,日本雅馬拓公司；BS 224S電子天平,德國賽多利斯公司；EYELA N-1000旋轉蒸發儀,日本東京理化器械株式會社；809 Titrando自動電位滴定儀,瑞士萬通公司；DVB-pDMS65 μm固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羅非魚熬煮液制備

將洗凈的羅非魚加工副產物切碎后于室溫下浸入復合脫腥液(紫蘇液質量分數7%、香芹液70%、白醋5%,魚肉與脫腥液料液比為1∶3[12])中60 min。瀝干水分后勻漿,以料液比1∶7(g∶mL)與蒸餾水均勻混合后轉入滅菌鍋,根據前期實驗設定熬煮時間為96 min,熬煮溫度為118 ℃,熬煮結束后用200目濾布過濾,將得到的魚湯進行真空濃縮(真空度0.95 MPa,濃縮溫度65 ℃,轉速100 r/min),濃縮至原有體積的20%,得到羅非魚熬煮液。

1.3.2 美拉德反應產物制備

吸取10 mL羅非魚熬煮液于消解管中,按比例加入木糖,調節初始pH值后密封,轉入油浴鍋中進行反應,反應結束后立即冰浴,降至室溫后備用。

1.3.3 美拉德反應條件優化

考察木糖添加量(質量分數1%、1.5%、2%、2.5%、3%),反應時間(20、40、60、80、100 min),反應溫度(110、115、120、125、130 ℃)以及初始pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8)對美拉德反應的影響,每項實驗重復3次。

1.3.4 正交試驗優化美拉德反應條件

在單因素試驗的基礎上,以感官評分為考察指標,選擇木糖添加量、反應時間、反應溫度、初始pH值為影響因素,設計正交試驗,因素及水平如表1所示。

表1 正交因素水平表

1.3.5 低分子質量香味中間體測定

美拉德反應產物中的低分子質量香味中間體可以用280 nm處紫外吸光度表示,吸光度越大,香味物質越多[13]。將美拉德反應產物抽濾后,稀釋100倍,以去離子水為參比,于280 nm處測定其吸光度。

1.3.6 褐變程度的測定

美拉德反應的最后階段,所產生的類黑精物質不斷增加,使產物顏色加深。將美拉德反應產物稀釋10倍,以去離子水為參比,于420 nm處測定吸光度,作為褐變程度的指標。

1.3.7 感官評定

將美拉德反應產物稀釋10倍,對待測樣品進行編號,由7名感官評定員(4男、3女)組成評價小組,根據表2中的感官評定標準對樣品進行打分,主要從海鮮味、色澤、外觀、甜味、腥味、焦苦味6個方向進行評分,每個評定方向5分,共30分,感官評分越高則表明可接受程度越高。

表2 感官評定標準

1.3.8 氨基酸分析

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定16種氨基酸。

1.3.9 揮發性成分分析

分別稱取5 mL樣液于頂空瓶中,封口后于55 ℃平衡20 min,調整好位置插入萃取頭后在60 ℃下萃取30 min。

氣相色譜條件：進樣口溫度230 ℃,解析3 min；升溫條件：色譜柱初溫35 ℃,保持4 min,5 ℃/min 升至90 ℃保持4 min后,再以8 ℃/min 升至230 ℃保持5 min；載氣He,流量1.0 mL/L。質譜條件：離子源(EI)溫度200 ℃；電子能量70 eV；掃描質量范圍35～500 amu。

結果采用計算機NIST 11普庫數據庫進行檢索,選取匹配度>80(最大值為100)的化合物,按面積歸一化法進行分析,得到各揮發性成分相對含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件對相關數據進行方差分析；采用Excel 2019 整理數據及繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 木糖添加量的確定

美拉德反應是羰基與氨基間反應,還原糖的添加量對美拉德反應產物的風味以及色澤起到重要影響。如圖1所示,隨著木糖添加量的增加,A280 nm與A420 nm也隨之增加,木糖添加量達到2%之后感官評分開始下降,結果表明還原糖的添加有益于美拉德反應體系的進行,讓其生成了更多的低分子質量香味中間體,但也直接導致了反應最后階段積累了更多的類黑精物質,使褐變程度增大。過高添加量的木糖在加劇反應程度的同時,自身也較難反應完全,感官上具有較重的甜味以及輕微的焦苦味,色澤較重,因此綜合考慮,確定木糖的添加量為2%。

圖1 木糖添加量對美拉德反應的影響

2.2 反應時間的確定

添加2%木糖作為美拉德反應的還原糖,在美拉德反應過程中,還原糖可產生具有甜味和焦糖味的低分子質量香味中間體,但美拉德反應時間的不同,低分子質量香味中間體生成量也隨之變化。因此美拉德反應的時間對產品的最終風味有著重要影響。由圖2可知,隨著反應時間上升,A280 nm與A420 nm均不斷增加,表明美拉德反應程度也在不斷增大,當反應時間達到60 min,A280 nm幾乎不再增加,可能由于長時間反應,更多的中間產物轉化為了最終產物,反應產物褐變程度不斷增大,色澤變深,出現明顯的焦苦味,風味變差,這也與感官評分結果相吻合。因此確定60 min為反應時間。

圖2 反應時間對美拉德反應的影響

2.3 反應溫度的確定

反應溫度對美拉德反應的影響極為明顯,溫度較低時,反應難以完全進行,風味不會有太大改變,但溫度較高時,反應速度會急劇加快,類黑精物質快速累積,產生焦苦味,風味也被嚴重破壞[14]。如圖3所示,反應溫度為120 ℃時,A280 nm和感官評分達到最高,但當溫度達到125 ℃,褐變程度急劇上升,A280 nm也開始下降,出現焦苦味,色澤呈褐色,嚴重影響感官評分,因此選擇120 ℃較為適宜。

圖3 反應溫度對美拉德反應的影響

2.4 初始pH值的確定

初始pH值對美拉德反應體系的影響極為明顯,pH較低時,氨基的分離受到影響,風味不佳；pH過高時,美拉德反應產物色澤較深,同時感官上產生焦苦味[15]。羅非魚熬煮液的pH值為(5.5±0.1),由圖4可知,隨著pH值的增加,熬煮液的褐變程度增大,pH 6.0～7.5時,低分子質量的香味中間體增加,pH>7.5時,香味中間體減少,美拉德反應的感官評分呈現先上升后下降的趨勢,當pH>6.5時,隨著pH值增加,熬煮液出現焦糊味,并且色澤加深,使感官評分降低,初始pH值為6.5時,其感官整體接受度較高,評分最佳,表明pH值對美拉德反應產物的褐變程度影響較大。綜合考慮,初始pH值選為6.5比較合適。

圖4 初始pH值對美拉德反應的影響

2.5 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上,以感官評分為考察指標,選擇木糖添加量、反應時間、反應溫度、初始pH值為影響因素,設計正交試驗,試驗結果如表3所示。極差分析結果表明,各因素對美拉德反應產物的影響為：初始pH值>木糖添加量>反應時間>反應溫度；感官評分結果表明,美拉德反應最佳工藝參數為A2B1C2D2,即木糖添加量2.0%,反應時間60 min,反應溫度120 ℃,初始pH值6.5。在此條件下進行驗證試驗感官評分為(25.6±0.33),所得美拉德反應產物風味較好,具有濃郁的海鮮風味。

表3正交試驗設計及結果

2.6 美拉德反應對氨基酸組成的影響

氨基酸對水產調味料的風味構成起到極其重要的作用,按呈味特性可將氨基酸歸納為以下幾類：鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)、甜味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸)[16-17]。由表4可知,反應前后減少較為明顯的氨基酸有：酪氨酸(25.00%)、賴氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%),表明發生交聯反應的苦味氨基酸大于降解生成的,致使苦味氨基酸含量減少；鮮味、甜味的氨基酸含量均有所增加：天冬氨酸(5.26%)、絲氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)含量增加,說明以上氨基酸均在反應過程中對風味的形成起到了重要的作用。研究表明,甘氨酸與丙氨酸同木糖反應可以產生醬香風味,使美拉德產物的風味得到進一步提升,此外,鮮味和甜味的氨基酸含量的增長也會為其帶來更高的層次性、醇厚度以及更佳的整體滋味[18]。實驗結果表明,美拉德反應可以降低熬煮液中的苦味氨基酸,增加鮮味、甜味氨基酸,使熬煮液的感官評分增加,有效改善羅非魚熬煮液的風味,使其風味更佳整體和諧。

表4 美拉德反應前后氨基酸組成的變化

2.7 美拉德反應前后揮發性物質的變化

采用GC-MS技術對羅非魚熬煮液以及美拉德反應產物進行揮發性物質分析,總離子流程圖如圖5、圖6所示。結果采用NIST 11普庫數據庫進行檢索,選取匹配度>80(最大值為100)的化合物,按面積歸一化法進行分析,得到各揮發性成分相對含量,詳見圖7及表5。美拉德反應前后均檢出50種揮發性物質,前后數量雖未發生變化,但化合物種類及相對含量皆有較大的改變,使整體風味得到了一定的提升。

表5 揮發性成分分析

圖5 羅非魚熬煮液揮發性成分總離子流程圖

圖6 美拉德反應產物揮發性成分總離子流程圖

圖7 美拉德反應前后揮發性物質種類及個數變化

羰基化合物是熱加工過程中肉香成分的特征化合物,主要來源是脂類物質的熱氧化降解以及氨基酸的降解[19-20],醛類物質的閾值較低,對食品的風味構成具有重要的貢獻,研究表明帶有6～10個碳的醛類物質對肉香味的形成起到關鍵作用[21]。羅非魚熬煮液主要檢測到的醛類物質有己醛(4.25%)、庚醛(0.33%)、壬醛(1.34%),反應后相對含量大幅減少,3種物質皆具有濃烈的脂肪香氣,稀釋后呈玫瑰及橙子的香味；另外,反應后也生成了新的醛類物質：2-甲基丁醛(6.95%),作為常用香料已廣泛用于食品工業中,具有可可香氣、水果香等風味,糠醛(1.04%)來源于糖類物質的降解,具有烤肉的香味。醛類物質的前后變化表明美拉德反應使熬煮液的肉香風味更加柔和、圓潤,具有層次感。酮類物質具有一定的堅果香、水果香,其閾值高于醛類物質,可以使食品整體風味得到增強,醛酮類物質的交互作用在魚、肉制品形成獨特風味的過程中發揮了巨大的作用[22-23]。醇類物質同樣來源于脂肪的氧化降解,閾值較高,除非以高濃度存在,否則對肉香味的形成貢獻很小,但仍具有相當的協同作用[24],如反應產物中檢測到的糠醇(6.08%),具有焦糖、醬香味,使特征風味進一步得到了增強。

氨基酸與還原糖在美拉德反應作用下產生呋喃、吡嗪等雜環類化合物,閾值極低,具有濃郁的堅果、烤肉等令人愉快的風味。呋喃類化合物及其衍生物對肉香的形成有較大的貢獻,反應前后其總相對含量由2.06%增長至5.53%；吡嗪類物質是具有較強風味和氣味的一大類物質[25],從羅非魚熬煮液中未檢出吡嗪類物質,而在美拉德反應產物中檢出8種。羰-氨縮合具有pH依賴性,是吡嗪形成的先決條件,氨基在低pH體系中會質子化,不能進行親核進攻,只有不帶電的氨基能夠與羰基縮合,因此酸性環境中羰-氨縮合速率較慢,難以生成吡嗪類物質[26]。羅非魚熬煮液的pH值為(5.5±0.1),屬于偏酸性環境,經工藝優化后調整至pH 6.5,實驗結果與先前報道的相一致,表明反應體系初始pH值對吡嗪類物質的產生起決定性的作用。

此外,在羅非魚熬煮液中也檢測到了三甲胺(35.8 %),作為魚腥味的標志性物質之一[27],反應過后相對含量僅為2.17 %,說明美拉德反應也具有一定的脫腥作用。酯類物質的相對含量也有所減少,主要是由于在美拉德反應的高溫下其發生水解作用,對香味有一定損失,但整體風味的提升可以有效彌補酯類物質的損耗。其余所檢測到的烯烴、烷烴、芳香族等化合物,閾值較高,對整體風味影響不大。

3 結論

經單因素試驗及正交試驗確定美拉德反應改良羅非魚熬煮液風味的最佳工藝條件為：木糖添加量2.0%,反應時間60 min,反應溫度120 ℃,初始pH值6.5,在此條件下進行驗證試驗所得感官評分為(25.6±0.33)；氨基酸分析結果表明,美拉德反應前后酪氨酸(25.00%)、賴氨酸(35.48%)、精氨酸(26.67%)等苦味氨基酸含量減少,天冬氨酸(5.26%)、絲氨酸(6.67%)、胱氨酸(4.67%)、脯氨酸(9.68%)、甘氨酸(6.84%)、丙氨酸(7.50%)等鮮味、甜味的氨基酸含量均有所增加,說明以上氨基酸均在反應過程中對風味的形成起到了重要的作用。揮發性物質分析表明,美拉德反應前后風味物質種類及數量均有所變化：醛類、醇類物質總相對含量減少,酮類物質有所增加,美拉德反應使羰基化合物間協同作用增強,形成更佳和諧、整體的風味,呋喃類、吡嗪類等雜環類化合物相對含量升高,進一步強化了特征風味。以上結果表明,美拉德反應大幅改善了羅非魚熬煮液原本單一的風味,在感官上帶來了濃郁的海鮮風味,此工藝具備開發天然水產調味料的相關條件,可為羅非魚加工業及調味品制造業提供一定的理論參考。