釀酒酵母和植物乳桿菌混合發酵對金銀花浸提液多酚物質的影響

崔亞鵬,許銳,陳澤元,陳雙喜

(河南大學 生命科學學院分析測試中心,河南 開封,475004)

金銀花是忍冬干燥的花蕾,具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調節、降血脂和抗氧化等生理功能[1-3]。1984年國家中醫藥管理局將其確定為35種名貴中藥材之一,后來又被定為藥食兩用品種。

微生物具有極強的生物轉化能力,能夠改善食品的風味,減弱毒性,改變食品成分[4]。液態發酵中多采用單一菌種如植物乳桿菌、酵母菌等,發酵后抗氧化性得到不同程度的提高,總多酚的含量也得到一定的提升。陳康等[5]使用植物乳桿菌對金銀花進行液態發酵,發現在浸提液中的綠原酸含量基本穩定。徐文流等[6]發現,金銀花經紅曲霉固態發酵后,綠原酸含量增加,抗氧化能力提高。為改善食品風味,近年來混合菌種發酵應用較為廣泛,在紅棗汁[7]、果酒[8]、蔬菜[9]等發酵中已經取得一些較好的結果。此外由于酵母菌和乳酸菌存在協同作用及代謝交換[10],也成為國內外學者研究的熱點之一。目前關于多菌混合發酵金銀花的研究較少,且研究多數集中在固態發酵改變物質的風味上,發酵的結果多數以物質總量表征[11],對發酵過程中各物質含量變化情況以及如何變化鮮有報道。本研究使用釀酒酵母和植物乳桿菌混合發酵金銀花浸提液,采用超高效液相色譜飛行時間質譜(ultra high performance liquid chromatography time of flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)和超高效液相色譜三重四極桿串聯質譜(ultra high performance liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry,UHPLC-QQQ-MS/MS)研究發酵前后金銀花浸提液的有效組分變化,為混菌液態發酵金銀花提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum),本實驗室篩選保藏。

1.1.2 實驗材料

金銀花,安徽皖印堂。

1.1.3 實驗試劑

綠原酸(批號PCS-191210)、咖啡酸(批號PCS-200110)、阿魏酸(批號PCS-190803)、木犀草素(批號PCS-191218)、木犀草苷(批號PCS-190918)(HPLC>98%),北京世紀奧科生物技術有限公司；DPPH、ABTS,麥克林試劑;其余試劑為國藥集團分析純。

1.2 儀器與設備

ZQZY-88CV振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司；SW MAGELLAN V7.2-SP1 TRA2PC多功能酶標儀,奧地利Tecan有限公司；LC-1290超高效液相色譜、C18超高效色譜柱(ZORBAX RRHD Eclipse Plus 2.1 mm×50 mm 1.8 μm)、LC-1290-TQ 6470 UHPLC-QQQ-MS/MS,美國Agilent科技有限公司；Tims Tof Pro飛行時間質譜儀,德國Bruker科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養

將活化后的釀酒酵母接種在PDA培養基中,32 ℃、150 r/min培養18 h待用,將活化的植物乳桿菌接種入MRS培養基中,35 ℃、150 r/min培養24 h待用,以OD600表征生物量。

1.3.2 金銀花浸提液及發酵液的制備

取粉碎后的金銀花,配制成質量分數為3%的濁液,水浴鍋中65 ℃浸提120 min,8 000 r/min離心15 min,在上清液中添加1%的葡萄糖,使用水浴鍋90 ℃消毒120 s,分別接種體積分數為2.5%的植物乳桿菌和釀酒酵母,在32 ℃、140 r/min發酵72 h獲得發酵液。對照組以相同方法處理,于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 黃酮含量的測定

采用AlCl3-NaNO2-NaOH比色法[12],結果以蘆丁計(單位mg/mL),繪制標準曲線,回歸方程Y=4.062 9x+0.037 76,R2=0.998 15。

1.3.4 多酚含量的測定

多酚含量的測定采用福林酚比色法測定[13],結果以焦性沒食子酸計(單位mg/mL),繪制標準曲線,回歸方程Y=18.4x+0.058 27,R2=0.993 07。

1.3.5 抗氧化活性檢測

DPPH自由基清除率：參考文獻[14]稍加調整。取樣液2 mL于試管中,加入2 mL的DPPH溶液,空白組以無水乙醇作對照,樣品溶液做參照,室溫下避光反應20 min測定其在517 nm處的吸光值。清除率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：A樣品,樣品組在517 nm處吸光值；A對照,對照組在517 nm處吸光值；A空白,空白對照組在517 nm處吸光值。

ABTS陽離子自由基清除率：參考文獻[15]稍加調整。ABTS工作液V(7.4 mmol/L ABTS)∶V(2.6 mmol/L K2S2O8)=1∶1避光保存過夜,用無水乙醇稀釋后得到工作液。反應總體系1 mL,樣品0.2 mL,工作液0.8 mL,反應時間30 min,以無水乙醇做空白對照。清除率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A樣品,樣品組在734 nm處吸光值；A對照,對照組在734 nm處吸光值；A空白,空白對照組在734 nm處吸光值。

1.3.6 定性和定量分析

定性分析：使用UHPLC-Q-TOF-MS對發酵前后的浸提液進行組分分析,將對照組和發酵組進行稀釋,使用0.22 μm濾膜過濾獲得待測液。分析方法如下：離子源ESI源,UHPLC柱溫40 ℃,進樣量5 μL,流速0.3 mL/min,流動相分別為0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)洗脫梯度(0～9 min,95%～90% A；10～20 min,75%～20%A；21～30 min,20%～10%A；30～35 min,10%～95%A)洗脫時間35 min,預實驗結果顯示金銀花有效成分在負離子模式下響應較好,故TOF-MS采用負模式進行檢測。質譜檢測結果使用Metabo Scape軟件進行譜庫檢索以及調取對應的二級碎片離子參考相應文獻[2]確定對應物質。

定量分析：使用LC-MS對相應物質進行定量。液相條件：HPLC柱溫40 ℃,進樣量5 μL,流速0.3 mL/min,流動相分別為0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)洗脫梯度(0～6 min,95%～92%A；6～10 min,92%～75%A；10～15 min,75%～60%A；15～20 min,60%～45%A；20～30 min,45%～15%A；30～40 min,15%～95%A)洗脫時間40 min。MS條件：干燥氣流速5.0 L/min,溫度300 ℃,鞘氣流速11.0 L/min,溫度250 ℃,噴霧氣45.0 psi,毛細管電壓3 500 V(-),正模式4 500 V(+)。各物質質譜檢測條件及標準曲線見表1。

表1 標準曲線及質譜條件

2 結果與分析

2.1 菌體生長及pH變化

由圖1可知,對照組OD600和pH變化不顯著,發酵組OD600與pH變化明顯；發酵組菌體快速增長并在24 h達到最大值,24 h后生物量維持相對穩定,發酵組pH在12 h內劇烈下降,由4.9下降至3.5。

a-對照組；b-發酵組

2.2 金銀花發酵浸提液不同時間多酚和黃酮含量的變化

如圖2所示,對照組黃酮和多酚含量呈現輕微下降趨勢,分別由71和48 mg/g下降至67和47 mg/g,發酵組黃酮由72下降至65維持至24 h,24 h后逐漸回升增高由65提升到79 mg/g；多酚呈現出明顯上升趨勢,由47.7提升到59.4 mg/g。

a-對照組；b-發酵組

2.3 發酵金銀花浸提液不同時間自由基清除能力的變化

經發酵后金銀花浸提液的抗氧化能力發生改變,結果如圖3所示,在DPPH自由基清除實驗中,對照組在0～72 h內整體相對穩定,發酵組的DPPH自由基清除率在各時間點均高于對照組,由初始的60%提升到71%,提升顯著；ABTS陽離子自由基清除實驗中發酵組的清除率在12 h時低于對照組,12 h后清除率較對照組得到提高。

a-DPPH自由基清除率；b-ABTS陽離子自由基清除率

2.4 發酵前后金銀花浸提液組分定性結果

使用UHPLC-Q-TOF-MS分析對照組和發酵結束(72 h)浸提液的組分變化,以火山圖和熱圖的形式展示結果(圖4)。火山圖展現出對照組與發酵組有較大的改變。由熱圖分析發現,發酵后浸提液中3,5-二咖啡酰奎尼酸、阿魏酰奎尼酸、木犀草素、莽草酸、脫氫莽草酸、肉桂酸等的含量有明顯的提升(P<0.05),葡萄糖、甘露糖、蜜二糖、塔羅糖、奎尼酸、香豆素、木犀草苷、當藥苦苷等的含量有著明顯的降低(P<0.05)。十四烷二酸、十三碳二元酸、十二碳二元酸、壬二酸等二元酸的含量也有較明顯的提升(P<0.1)。

a-火山圖；b-組分熱圖

2.5 金銀花有效組分的定量分析結果

依據2.4的檢測結果,選取金銀花的有效成分,使用LC-MS的多反應監測模式對發酵前后綠原酸、木犀草苷、木犀草素、阿魏酸、咖啡酸進行測定,結果如表2所示。5種物質含量的變化與TOF-MS的檢測結果吻合,金銀花浸提液經發酵,綠原酸含量由26.566 mg/g提升到31.338 mg/g,提升17.96%；木犀草苷由0.897 mg/g下降至0.063 mg/g；阿魏酸、咖啡酸和木犀草素的含量有所提高。

表2 發酵組的LC-MS定量結果

3 結論

采用UHPLC-Q-TOF-MS對金銀花浸提液的成分進行定性分析,發現發酵使得浸提液的組分發生改變。其中有191種物質含量下降,182種物質含量上升。奎尼酸的含量明顯下降(P<0.05),但莽草酸的含量卻在明顯增加(P<0.05),證明奎尼酸在發酵的過程中被利用。同時阿魏酰奎尼酸、綠原酸含量提升明顯(P<0.05),因此在發酵的進程中可能產生了一些酶類,能夠使咖啡酸和阿魏酸與奎尼酸反應,從而提高綠原酸和阿魏酰奎尼酸的含量。由木犀草苷含量的變化與木犀草素的變化推測,在發酵進程中產生某些物質能夠將苷類物質的糖苷降解,暴露出苷元,當藥苦苷、馬錢苷含量的降低也源于此。

本研究采用植物乳桿菌和釀酒酵母混合發酵金銀花浸提液,浸提液經發酵后,黃酮的含量提升10%、多酚的含量提升了24%；抗氧化性能得到提高,自由基清除率得到一定的提升,DPPH自由基清除率由55%提升到71%,ABTS陽離子自由基清除率由59%提升到64%；此外,部分糖苷類化合物被降解,分子量變小更易被吸收利用。因此,采用混菌發酵的方法能夠提升金銀花浸提液的品質,同時也為金銀花飲品的開發提供了理論基礎。