魚露中組胺降解菌的分離篩選及耐受性

朱翠翠， 王海英， 趙玉瑩， 徐 瑩， 汪東風

（中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島266003）

生物胺是一類含氮的低相對分子質量且具有生物活性的脂肪族或雜環族有機化合物，在生物體內產生，在某些食品尤其是發酵產品中普遍存在[1]。生物胺主要由氨基酸脫羧酶作用于相應的游離氨基酸產生，精胺和亞精胺由腐胺利用亞精胺酶和精胺酶作用產生[2-3]。 一定量的生物胺對動植物和微生物有積極作用。 然而，人體攝入過量的外源性生物胺，會打亂體內生物胺的平衡[4-6]。 一般攝入超過100 mg/kg 的生物胺， 就會使人體的排毒系統受阻從而導致中毒，危害人體神經和心血管系統，甚至嚴重到危害生命[7]。 常見的生物胺有組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺、章魚胺、精胺和亞精胺等，其中組胺毒性最強，其次是酪胺[8]。 組胺中毒表現為過敏原型反應，其特征是呼吸困難、皮疹、嘔吐、發燒和高血壓等[9]。 組胺中毒事件在全世界范圍內均有發生。 比如，Velut 報道了一起發生于法國巴黎的黃鰭金槍魚中毒事件， 發現煮熟的黃鰭金槍魚中，組胺含量過高是導致人體食物中毒的主要原因[10]。李秋月等對桐鄉市某公司員工中毒事件進行調查，發現熟鮐魚肉中組胺為46.4 mg/hg， 其中進食鮐魚者發病率為31.3%[11]。 此外，一些發酵食品中組胺含量也較高，根據已有研究，意大利半干干酪中組胺為390~400 mg/kg； 泰國549 個市售魚露產品中組胺質量濃度為200~600 mg/L[12]。

這些食品中生物胺帶來的安全性問題，已引起國際上的關注，雖然國際上對食品中的生物胺還沒有統一限量標準，但部分國家根據不同食品特性給出了組胺限量標準：美國食品藥品監督管理局對金槍魚及相關魚類中組胺的限量標準為50 mg/kg[13]；2015 年我國發布的《鮮、凍動物性水產品衛生標準》中規定高組胺魚類組胺低于40 mg/hg，其他海水魚類低于 20 mg/hg[14]；歐盟委員會第2073/2005號法規要求新鮮魚和魚加工產品中的組胺分別低于200 mg/kg 和 400 mg/kg[15]。

為此， 應盡可能降低相關食品中生物胺的含量，尤其是組胺的含量。 在食品生產過程中降低生物胺含量的方法主要有3 種：1）降低前體物氨基酸水平；2）抑制產胺菌（具有氨基酸脫羧酶活性）的生長；3）降低氨基酸脫羧酶活性[16]。 近年來，篩選具有降解生物胺能力的微生物，成為控制食品中生物胺的研究熱點，尤其是對組胺含量的控制。 目前已篩選得到多株具有組胺降解活性的菌株，Zaman 從魚露中篩選得到的Staphylococcus carnosus FS19 菌株能降解魚露中質量分數29.1%的組胺[17]。 Niu 等篩選出一株Lactobacillus plantarum CAU 3823，可降解質量分數45%的組胺[18]。鄧紅梅等從香腸中分離得到一株Staphylococcus epidermidis PZ2，其對組胺最大減少量為65.011 μg/mL[19]。目前所篩選到的菌株，存在生物胺降解率較低，環境適應性差等問題，總體而言， 微生物降解生物胺方面的研究還比較薄弱。因此， 作者從魚露中篩選具有高效降解組胺的菌株，對于開展生物胺降解菌株的實際應用研究以及提高發酵食品的安全性都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用魚露樣品來自山東省威海市榮成日鑫水產有限公司。

組胺鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽、色胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、精胺鹽酸鹽、亞精胺鹽酸鹽、苯乙胺鹽酸鹽、章魚胺鹽酸鹽：美國 Sigma 公司產品；DNS-Cl： 中國上海 aladdin 試劑公司產品；乙腈、甲醇（色譜級）：德國 Merck 公司產品；鹽酸二甲基對苯二胺：天津博迪化工有限公司產品；α-萘酚：上海麥克林生化科技有限公司產品；正庚烷、丙酮等所有分離用有機溶劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 主要儀器與設備

Agilent 1100 型高效液相色譜儀： 安捷倫科技有限公司產品；YGC-12 型氮吹儀：鄭州寶晶電子科技有限公司產品；QYC 211 型恒溫振蕩培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司產品；SW-CJ-2F 型超凈臺： 蘇凈集團安泰公司產品；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器： 上海申安醫療器械廠產品；UV-2102 PC 型紫外可見分光光度計： 上海洪福儀器儀表有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基配制 MRS 培養基： 蛋白胨10 g/L、酵母粉4 g/L、葡萄糖20 g/L、牛肉浸粉8 g/L、吐溫1 g/L、（三水）磷酸氫二鉀 2 g/L、（三水）乙酸鈉 5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L。 若為固體培養基，需加入瓊脂 20 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

LB 培養基： 胰蛋白胨 10 g/L、 酵母膏 5 g/L、NaCl 10 g/L。 若為固體培養基，需加入瓊脂20 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD 培養基：蛋白胨 20 g/L、酵母膏 10 g/L、葡萄糖20 g/L。 若為固體培養基，需加入瓊脂20 g/L，121 ℃高壓滅菌20 min。

用于生物胺鑒別的雙層顯色培養基[20]：1）下層培養基， 分別在MRS、LB 或YPD 固體培養基上加入0.05 g/L 的磷酸吡哆醛以及混合氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、酪氨酸、精氨酸、鳥氨酸各 5 g/L），pH 5.2， 分別命名為 MRSA、LBA、YPDA；2）上層培養基，溴甲酚紫 0.06 g/L、瓊脂 20 g/L，pH 5.2，121 ℃高壓滅菌 20 min， 冷卻至室溫倒平板。

加生物胺液體培養基： 在 MRS、YPD 和 LB 液體培養基上加入9 種生物胺各50 mg/L。 分別命名為 MRSB、YPDB、LBB。 若為固體培養基，需加入瓊脂 20 g/L，121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.3.2 生物胺降解菌的初篩 樣品處理：將魚露樣品置于無菌裝置器中， 保持低溫并運回實驗室，在無菌操作環境下將魚露樣品進行分裝。

取5 g 魚露樣品于100 mL 無菌生理鹽水中，搖床振蕩 30 min， 取 1 mL 液體分別加到 MRS、LB 和YPD 液體培養基中，培養24 h。 取出1 mL 培養液，用無菌水按照 1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108倍稀釋富集的微生物， 然后每個樣品取200 μL 稀釋液分別涂布于MRSA、LBA 下層培養基上，37 ℃培養，同時涂布于YPDA 下層培養基上，28 ℃培養48 h 后取出，再將上層培養基（50 ℃左右）倒入上述下層培養基（MRSA、LBA 和 YPDA），繼續培養，觀察并記錄實驗結果，菌株顯紫色的為陽性（即產生物胺菌），不變色或顯黃色為陰性菌（不產生物胺菌）[20-21]。 挑取陰性菌落并分離純化3 次，保存在斜面培養基上，4 ℃保藏備用。

對獲得的陰性菌進行氧化酶實驗，檢測其是否具有氧化酶活性，實驗步驟為：取單菌落于無菌白色濾紙， 加入20 μL 質量分數1%的鹽酸二甲基對苯二胺溶液，呈現粉紅色，則為陽性，再加入適量質量分數1%的α-萘酚乙醇溶液，于30 s 內呈現藍色并逐漸加深，視為陽性，陰性則不變色，結果呈陽性的為所需菌株[22]。

1.3.3 生物胺降解菌的復篩 將1.3.2 獲取的陰性菌株，接種于MRS、LB 和YPD 斜面培養基上，分別在37 ℃和 28 ℃下培養 24 h 后， 進行2 次斜面活化，備用。

種子液制備：從活化好的斜面培養基中，挑取單菌落，接種于MRS、LB 和YPD 液體培養基中，分別在37 ℃和28 ℃下，以 180 r/min 振蕩培養24 h。

用生理鹽水 （含生物胺50 mg/L） 調整菌液濃度， 取 1 mL 菌液接種到 MRSB、YPDB、LBB 培養基中，72 h 后，在 4 ℃下以 3 500 r/min 離心 10 min，取上清液備用， 對照組為不加菌液的含胺液體培養基。采用DNS-Cl 進行衍生，利用HPLC 法測定樣品中生物胺含量，經計算得降胺率，從中篩選降胺效果較好的菌株，并進行保藏。

1.3.4 生物胺降解率的測定 準確稱取1.00 g 魚露樣品于10 mL 容量瓶中， 加入0.1 mol/L 的 HCl定容至 10 mL， 超聲 2 min，4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，取上清液，即為生物胺提取液。

參考文獻[23-24]中生物胺的衍生方法并略微修改。 稱取樣品 0.5 mL，加入 100 μL 2 mol/L NaOH和150 μL 的飽和碳酸氫鈉溶液與之混合，再加入1 mL 10 mg/mL 的 DNS-Cl（用丙酮溶解），在 40 ℃以200 r/min 振蕩培養， 水浴反應45 min。 再加入50 μL 體積分數25%的氨水，25 ℃下靜置30 min，加入3 mL 正庚烷萃取，振蕩混勻后，靜置分層，取上層有機相于10 mL 離心管中，40 ℃下用氮氣吹干， 取1 mL 乙腈使殘留物完全溶解， 用0.22 μm 的有機膜過濾后加入進樣小瓶，測定后計算降解率。

表1 HPLC 測定生物胺梯度洗脫程序Table 1 Determination of biogenic amines gradient elution procedure by HPLC

式中：X 為生物胺降解率，%；C1為不含菌株的空白樣品生物胺質量濃度，mg/L；C2為接種菌株的樣品生物胺質量濃度，mg/L。

1.3.5 生物胺降解菌株的菌種鑒定 將菌株接種于液體MRS 培養基中，37 ℃下以180 r/min 振蕩培養 24 h， 取 1 mL 菌液于 1.5 mL 無菌離心管中，12 000 r/min 離心 2 min 收集菌體，100 ℃水浴 2 min 后液氮速凍， 重復上述步驟 5 次， 備用。 使用ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS-4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）引物進行菌落PCR 擴增， 擴增體系為 50 μL：45 μL 金牌 Mix（green）、2 μL ITS1、2 μL ITS4、1 μL 模板 DNA。 擴增程序如下：98 ℃預變性5 min 后進入循環，98 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s， 循環 30次，72 ℃修復延伸 10 min，4 ℃終止反應。將 PCR 產物送往青島擎科公司進行測序，登錄NCBI，將所得序列與數據庫已知序列進行相似性比對。

1.3.6 環境因素對降胺菌生長及降胺能力的影響對 1.3.3 保藏的 P. kudriavzevii-MZ5 菌株， 在 MRS液體培養基中進行活化培養，4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，收集菌體，使用無菌生理鹽水將菌液制備成 1.0×108CFU/mL 的菌懸液。 取 1 mL 菌液接種到50 mL MRS 液體培養基中，其中，組胺質量濃度梯度設為 10、30、50、70、100、200 mg/L；pH 梯度設為 3、4、5、6、7、8、9， 組胺質量濃度均為 50 mg/L；NaCl 溶液質量濃度梯度設為 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 g/dL，組胺質量濃度均為 50 mg/L；乙醇體積分數梯度為 2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%，組胺質量濃度均為50 mg/L。 對照組為對應不加組胺的MRS 液體培養基，37 ℃以180 r/min 振蕩培養72 h 后取樣， 按照1.3.4 檢測培養液中剩余組胺質量濃度。

2 結果與分析

2.1 生物胺降解菌的初篩

雙層顯色板法是根據平板的顏色變化，甄別并挑選出能利用生物胺且不產生物胺的微生物。 如圖1 所示，陽性樣本經過雙層顯色板法培養后，由于生物胺的產生，導致培養基pH 升高，使得上層培養基中的溴甲酚紫（變色范圍：pH 5.2~6.8，由黃色變為紫色）出現顏色反應[21]，即顯紫色，而不變色或顯黃色的為陰性菌株， 并對陰性菌株進行胺氧化酶實驗。 初步分離出25 株陰性菌株 （如圖1 中圈出菌落），可能是潛在的降胺菌株，胺氧化酶實驗結果見圖2，結果表明陰性菌株具有較強的胺氧化酶活性，故將其作為后續研究對象。

圖1 雙層顯色板法對生物胺降胺菌的分離篩選Fig. 1 Separation and screening of bioamine-lowering strains by double-layer chromogenic board method

圖2 胺氧化酶實驗結果Fig. 2 Results of amine oxidase experiment

2.2 生物胺降解菌的復篩

當 25 株陰性菌株分別在 MRSB、YPDB、LBB 中培養24 h，生物胺降解率見表2，以組胺降解率大于10%為初篩選對象， 篩選到的菌株有 MZ1、MZ5、YR1、YM3。 將上述 4 株菌株培養 72 h，生物胺降解效果見表3。 4 株菌株組胺降解率均在78%以上，具有較強的組胺降解活性。其中MZ5 的組胺降解率最高，能達到91.97%，同時也發現，該菌株對其他生物胺降解率也優于另外3 株。 所以，經復篩得到的菌株，尤其是MZ5 能夠在營養豐富的環境下利用生物胺，也能夠適應更為復雜的發酵環境，故將其作為后續研究對象。

表2 25 株潛在降胺菌培養24 h 后的復篩降胺效果Table 2 Secondary screening effect of 25 potential amine-lowering strains cultured for 24 h

表3 4 株菌株培養72 h 后的降胺效果Table 3 Amine-lowering effects of 4 strains cultured for 72 h

2.3 MZ5 的菌種鑒定結果

通過青島擎科公司進行ITS rRNA 基因測序，測序結果經NCBI 上的BLAST 對比，結果發現MZ5菌株與庫德畢赤酵母的相似度達到99.72%，則認定該菌株為庫德畢赤酵母 （Pichia kudriavzevii，GenBank accession number：MW642244）， 且 MZ1、YR1 和YM3 的NCBI 比對結果也均為庫德畢赤酵母。 庫德畢赤酵母是發酵食品（牛奶乳清[25]）中的常見菌，在多種其他食品中也有存在[26]。此前沒有文獻報道該菌具有降解生物胺的能力。 另外，對比已報道的生物胺降解菌， 如張楠篩選的 3 株菌株Lactobacillus plantarum 、Pediococcus pentosaceus 、Weissella cibaria， 混合接種于川辣香腸中， 可降低30.27%的組胺[27]；Lee 等篩選的多粘芽孢桿菌D05-1應用于咸魚中， 可降低34.00%的組胺和30.00%的總 生 物 胺 （ 均 為 質 量 分 數 ）[28]。 該 菌 株 （P.kudriavzevii-MZ5） 可以降解組胺等9 種生物胺，組胺降解率更高，后續將開展將其用于具體發酵食品降解組胺的研究。

2.4 P. kudriavzevii-MZ5 菌株耐受性

2.4.1 P. kudriavzevii-MZ5 菌株的生長曲線 在 MRS、MRSB 培養基中 P. kudriavzevii-MZ5 培養72 h 的生長曲線見圖3。 可知該菌株在0~3 h 內處于遲滯期，在3 h 后生長迅速，在24 h 時OD600已經由 3 h 時的 0.1 增加到 0.8， 表明從 3 h 開始，P. kudriavzevii-MZ5 菌株進入對數生長期， 大約到24 h 時生長趨于穩定。 此外，生物胺的存在并沒有對菌株的生物量造成影響， 表明P. kudriavzevii-MZ5 菌株對生物胺的耐受能力較強，但也未表現出生物胺對生長的促進效應。

圖3 P. kudriavzevii-MZ5 在無生物胺和含生物胺培養基中的生長曲線Fig. 3 Growth curves of P. kudriavzevii-MZ5 in biogenic amine-free and biogenic amine-containing media

2.4.2 初始組胺質量濃度的影響 研究結果表明，該菌株在3 h 時開始進入對數生長期，將MZ5 接種到含不同初始組胺質量濃度的培養基中培養72 h后，分析其組胺降解率，結果見圖4。P. kudriavzevii-MZ5 菌株在組胺質量濃度為10~200 mg/L 的降解率可達52.34%以上，其中質量濃度為50 mg/L 時降解率最高，為82.61%。 組胺質量濃度對其生長無影響，但對組胺降解率有影響，這可能是由于適量的組胺質量濃度（0~50 mg/L）存在底物誘導效應，隨著組胺質量濃度的增加，組胺降解率增加；高質量濃度（50~200 mg/L）組胺對其生長沒有影響，但隨著組胺質量濃度升高組胺降解率下降，說明培養基中初始組胺質量濃度高時，P. kudriavzevii-MZ5 對組胺的有效降解能力受到抑制。 可能是環境中高質量濃度的組胺未被轉運到菌體內，而胺氧化酶等生物胺降解酶都是胞內酶，酶與底物的空間距離阻礙最終導致生物胺降解能力下降；也可能是胞內高質量濃度組胺降低了組胺降解酶的活性或者表達量。

圖4 組胺質量濃度的影響Fig. 4 Effects of histamine mass concentrations

2.4.3 乙醇的影響 從圖5 可以看出，隨著乙醇體積分數的增加， 菌液的 OD600逐漸下降，即P. kudriavzevii-MZ5 的生長曲線呈現下降趨勢，在乙醇體積分數 10%~25%時， 對應的 OD600低于0.026，菌株生長受到抑制。 乙醇體積分數為5%時，對應的組胺降解率最高，可達73.01%；乙醇體積分數大于5%時，組胺降解率下降；當乙醇體積分數為10%時，對應的組胺降解率為1.02%。 這可能是高含量乙醇抑制了微生物生長，進而組胺降解代謝活動也受到影響。

圖5 乙醇體積分數的影響Fig. 5 Effect of ethanol volume fraction

2.4.4 pH 的影響 隨著pH 的增加，環境中組胺對P. kudriavzevii-MZ5 的生長并無顯著影響。 從圖6可知，MZ5 菌株可在pH 3~9 的環境下生長。 在pH 3~5 時，該菌株的生物胺降解率和生物量隨著pH 升高而增加，這可能由于低pH 環境下，菌株的生長較為緩慢，導致生物量不高，或者在該環境中的胺氧化酶活性較低[29]；當pH 大于7 時，該菌株生物胺降解率隨pH 升高而降低，這可能是因為pH 對酶活性造成了影響，其中在pH 為7 時，組胺降解率最高可達98.61%。

圖6 pH 對菌株生長及生物胺降解率的影響Fig. 6 Effects of pH on the growth of strains and the degradation rate of biogenic amine

2.4.5 鹽度的影響 在NaCl 質量濃度低于12 g/dL時，P. kudriavzevii-MZ5 的生物量在有組胺的培養基中高于無組胺的培養基， 當NaCl 質量濃度高于12 g/dL 時，MZ5 的生長受到限制 （見圖 7）。 隨著NaCl 質量濃度增加， 該菌株的降組胺效果逐漸降低，質量濃度0~2 g/dL 以內可維持75.79%~86.84%的組胺降解率，質量濃度在4~8 g/dL，組胺降解率為35.19%~42.15%，NaCl 質量濃度高于 10 g/dL 時該菌基本無組胺降解能力（低于1%）。 這可能是因為高質量濃度的鹽抑制了菌株的生長，也可能是因為高質量濃度的鹽抑制了菌株氧化酶的活性[30]。 還可能是高鹽導致酵母菌細胞壁增厚，細胞膜滲透性受到影響，進而影響了胞外組胺進入胞內的速度和數量。

圖7 NaCl 質量濃度對菌株生長及組胺降解率的影響Fig. 7 Effects of NaCl mass concentrations on the growth of strains and the degradation rate of biogenic amine

3 結 語

從傳統發酵魚露中篩選出25 株潛在降胺菌，通過生物胺降解能力和組胺降解率的檢測，從MRS培養基中選出一株降解組胺能力最高的菌株MZ5。經鑒定該菌株為Pichia kudriavzeii。 P. kudriavzevii的生物量不受組胺初始質量濃度的影響，但其生長和降解組胺的能力均受到乙醇、pH 和鹽等因素不同程度的影響，更多影響因素和機理還需要繼續開展研究。 該菌株可作為發酵制劑應用于發酵食品中降低組胺含量，為發酵制品的工業化生產和安全性提供良好的理論依據。