黃酒釀造中氨基甲酸乙酯控制關鍵技術研究

黃酒是中國最古老的酒種，被列入重點扶植和發展的酒精飲品之一。 但黃酒的傳統釀造采用多菌種、邊糖化邊發酵的工藝，除了產生乙醇、功能寡肽和大量各類香氣物質外，還可能會產生或不慎引入一些不利于人體健康的物質，主要包括氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)、甲醛、生物胺和黃曲霉毒素等。

近年來，江南大學、浙江大學等科研人員針對黃酒釀造中可能產生的氨基甲酸乙酯危害物，深入研究其生成積累規律與阻斷機制、功能菌株與酶制劑篩選、全過程減控工藝優化與控制技術集成、檢測方法等，為黃酒產業安全生產提供技術支撐。程艷等（2017）以一株黃酒生產工業菌株釀酒酵母XZ-11 為研究對象，采用ARTP 誘變和高通量篩選策略，獲得尿素積累量較低菌株，使用實時定量PCR 技術檢測氮代謝中尿素代謝和轉運相關基因(DUR1,2 和DUR3)的變化，篩選得到一株尿素高效穩定性利用菌株5-11C，其尿素積累量比釀酒酵母XZ-11 降低了50.6%， 實時定量熒光PCR 結果表明， 與尿素代謝和轉運相關的基因(DUR1,2 和DUR3)表達量分別提高了3.3 倍和2.2 倍。 方若思等（2021）研究添加鳥氨酸氨甲酰基轉移酶對氨基甲酸乙酯及黃酒基礎品質的影響， 其采用基因工程手段從短乳桿菌中克隆并大量表達鳥氨酸氨甲酰基轉移酶，經Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂純化后添加到黃酒發酵的不同階段。結果表明：在發酵中期添加的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶能顯著降低氨基甲酸乙酯的質量分數，最高可降低至原質量分數的15%，且對其主要前體物——尿素和瓜氨酸均有影響，同時檢測黃酒的理化品質，結果表明游離氨基酸、揮發性風味物質及味覺特性差異不顯著， 說明添加鳥氨酸氨甲酰基轉移酶未對產品性質產生影響。 中國專利CN202010922066.1 公開了一種降低黃酒中氨基甲酸乙酯含量的方法， 其提供了一種低產尿素和氨基甲酸乙酯的重組釀酒酵母S. cerevisiae NaDUR1,2/DUR3-Δcar1，此重組釀酒酵母以釀酒酵母Na 為宿主，敲除編碼精氨酸酶的基因CAR1， 并且， 高效表達編碼脲基酰胺酶的基因DUR1,2 和編碼尿素轉運蛋白的基因DUR3；使用此重組釀酒酵母生產得到黃酒發酵液中，尿素的質量濃度低至3.0 mg/L，分別較釀酒酵母Na 和出發菌株S. cerevisiae NaDUR1,2-Δcar1 降低了92.1%和43.4%。 CN201911019263.6 公開一種降低黃酒釀造過程中尿素和氨基甲酸乙酯含量的方法， 向黃酒釀造體系中添加酒糟谷蛋白進行發酵， 以原料米質量計，酒糟谷蛋白添加量為0.5~8 g/hg，通過調控釀酒過程中酵母可利用的氮源組成，有效地抑制尿素循環，減少精氨酸的降解，從而減少EC 的形成。 CN201510812131.4 公開了一種可降低黃酒發酵中氨基甲酸乙酯積累的方法， 其使用氮代謝物阻遏效應調控因子改造了的基因工程菌， 其中酵母工程菌消除了調控因子Gln3p 和Gat1p 的核定位調控序列并突變了核定位序列上的磷酸化位點。 在模擬的黃酒發酵體系中，基因工程菌發酵的黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯的含量分別下降了63%和72%， 其中氨基甲酸乙酯質量濃度已經降至55.53 μg/L，同時主要的營養物質和特征性風味物質的含量差異很小。 CN201210125030.6 公開了一種黃酒用氨基甲酸乙酯降解酶產生菌，該發明菌株分類命名為變幻青霉（Penicillium variabile）JN-A525，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNo.5763。 該菌株的擴增ITS區全序列其氨基酸序列為SEQIDNO:1。 該菌所產的EC 降解酶，最適pH 相對較寬為4.0~6.0，最適溫度為50 ℃，該菌產生的酶在模擬黃酒（乙醇15%，EC 3%，pH 4.4）條件下對氨基甲酸乙酯（EC）有相對較強的水解能力， 所產EC 降解酶有在清酒、 黃酒、 米酒等發酵食品中去除已產生的微量EC 與MC 的應用潛力。CN201510218597.1 公開了一種降解尿素和氨基甲酸乙酯的耐乙醇雙功能酶及其應用， 該酶是來自于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis 9945A)的脲酶，能夠耐受高濃度乙醇的同時高效降解氨基甲酸乙酯。 該發明利用大腸桿菌表達系統BL21(DE3)/pRSFDuet-1，成功實現了具有EC 水解酶活力的脲酶基因的高效表達，以EC 為底物時酶活達到2.93 U/mL，以尿素為底物時酶活達到5.81 U/mL。重組酶在體積分數20%的乙醇中37 ℃保留4 h，以EC 為底物時仍可保留其50%以上的活性。

黃酒中EC 的研究已取得一系列成果， 但如何在不影響黃酒品質的條件下， 高效經濟地控制并去除EC，實現大規模工業化應用，提高我國傳統發酵食品行業核心競爭力與國際影響力，是行業人員今后研究的重點方向。