1 例臨床診斷為17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥患兒及其父母和哥哥的基因檢測分析

席可望，李珊，湯旭磊，傅松波，李娟，成建國

1 蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730099；2 蘭州大學第一醫院內分泌科3 蘭州大學第一醫院中心實驗室

先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一種較常見的常染色體隱性遺傳病。患者因腎上腺皮質類固醇合成途徑中的關鍵酶缺乏，引起皮質激素合成障礙，刺激促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）合成增多，導致腎性高血壓、低血鉀、性發育障礙等［1］。CAH 主要分為兩大類：典型腎上腺皮質增生癥和非典型腎上腺皮質增生癥，前者以21-羥化酶缺陷（90%～95%）最常見，后者包括11β-羥化酶缺陷、17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥、3β 脫氫酶缺陷、皮質酮甲基氧化酶缺陷及先天性類脂質性腎上腺增生［2］。其 中17-α 羥化 酶/17，20-裂解酶缺陷癥（17α-hydroxylase/17，20-lyase deficiency，17OHD）較為罕見，約占CAH 的1%［2］。細胞色素P450c17 酶（Cytochrome P450c17 enzyme，CYP17A1）基因突變可導致類固醇激素缺乏，導致糖皮質激素和性激素減少，但因中間產物去氧皮質酮（Desoxycorticosterone，DOC）累積代償皮質醇不足，患者出生后的一段時間并無特殊臨床表現，導致17OHD早期很難確診，且部分患者無陽性家族遺傳史。基因缺陷篩查可有助于明確疾病診斷，指導臨床制定合理的方案，提高患者生存質量［3］。目前臨床關于17OHD的診斷及治療方法相關報道較少。我們收治了1例疑似17OHD的患兒，檢測患兒及其家系的基因情況，了解17-α羥化酶/17，20-裂解酶缺陷癥患兒的基因變異及遺傳情況，為本病的診斷及治療方案的制定提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒，3 歲，女性外貌，因“性特征異常3個月余”于2020年11月12日就診我院，以“兩性畸形”收住入院。患兒父母于入院前3 個月發現患兒下腹部橢圓形包塊，伴反復多次嵌頓，無惡心、嘔吐，無腹痛、腹脹、腹瀉。于當地醫院就診，當地醫院行“剖腹探查術”，術中發現雙側鞘突均未閉合，雙側“子宮圓韌帶”近內環口約1 cm 處分別可見約1 cm 直徑腫物，質中，進一步行“腹腔鏡探查+雙側腹股溝區腫物切除活檢+雙側腹股溝斜疝疝囊高位結扎術”，術后患兒恢復良好。雙側腹股溝腫物病理檢查顯示：纖維組織內可見較多小管狀結構，形態學似曲細精管，呈結節狀排列，周圍可見大量后壁血管，病理診斷為：兩性畸形？。染色體檢查結果顯示，患兒染色體核型為“46，XY”。當地醫院診斷為雙側腹股溝斜疝、兩性畸形。為進一步診治轉至我院。患兒發病以來精神食欲良好，既往體健否認高血壓史。父母體健，非近親結婚，無相關遺傳病家族史。入院體格檢查：血壓：111/55 mmHg，全身膚色略深，雙側乳腺未發育，青春期發育Tanner分期Ⅰ期，外陰口呈幼女型，無陰毛，外陰無色素沉著，可見陰道口。生長發育評估：身高105 cm，體質量17.5 kg，均處于生長曲線第97百分位數，智力發育在正常范圍內。輔助檢查結果為電解質：血鉀4.01 mmol/L，血鈉141 mmol/L，血氯109 mmol/L，血鈣2.4 mmol/L，無機磷1.71 mmol/L，血鎂0.79 mmol/L。激素檢測結果為：血清類胰島素生長因子-1（IGF-1）99.7 ng/mL、胰島素樣生長因子結合蛋白-3（IGFBP3）4.64 μg/mL、4pM 皮質醇（Cor）1.16 μg/mL、8AM 促腎上腺皮質激素（ACTH）分別為44.6 ng/mL、黃體生成素（LH）0.42 mIU/mL、卵泡刺激素（FSH）27.92 mIU/mL、雌二醇（E2）＜10.00 pg/mL、脫氫表雄酮（DHEA）＜15.0 μg/dL、孕酮（P）1.7ng/mL、睪酮（TT）1.37 ng/mL、泌乳素（PRL）15.2 ng/mL，雄烯二酮（A4）＜0.300 ng/mL、尿游離皮質醇（UFC）21.56 μg/24 h、24 h 尿17 羥類固醇（17-OHCS）1.83 mg/24 h、24 h 尿17-酮類固醇（17-KS）0.39 mg/24 h、17α 羥孕酮（17α-OHP）0.07 ng/mL、腎素（Renin）＜0.50 ng/L、醛固酮（ALD）85.01 ng/L。左側手部X 線骨齡評估：骨齡與實際年齡大致相符；雙側腎上腺彩超：雙側腎上腺未見明顯異常；婦科B超檢查未探及子宮及雙側卵巢。

1.2 患兒及其家系全基因組檢測 ①提取外周血基因組DNA：簽署知情同意書后，抽取患兒、哥哥及其父母外周血各8 mL，以EDTA K2抗凝，將外周血送上海瀚垚生物醫學科技有限公司。采用TIANamp Micro DNA 提取試劑盒（DP316，天根生化科技有限公司，中國）根據標準程序操作提取患兒及其他家庭成員基因組DNA。②PCR 擴增基因組DNA：通過降解、環化將DNA 轉化為單鏈環狀DNA 后對其進行末端修復，PCR 擴增構建DNA 文庫。DNA 文庫與捕獲的Capture Library 雜交，使用Dynabeads?MyoneTMStreptavidin T1 捕獲雜交DNA，同時用PCR 擴增捕獲文庫，并使用Q-PCR 文庫進行質檢。③基因組DNA 測序分析：將DNA 文庫上樣到流動槽然后置于測序儀中，使用Illumina 測序儀器進行測序。Illumina測序儀器使用檢測拷貝數芯片，可檢測出染色體非整倍體以及100 kb以上基因組拷貝變異［4］。運用BWA 軟件比對到參考基因組上（hg19 版本），對測序深度、均一性、探針特異性等數據進行統計分析。用GATK 軟件對這個樣本的比對數據進行多態性位點的檢測，對單核苷酸多態性（single nucleotidepolymorphisms，SNPs）和插入缺失突變（InDels）等數據進行統計和分析，查找SNPs 及InDels 在千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及邁基諾內部1000正常漢族人群數據庫頻率，利用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++等數據庫對SNPs及InDels 的致病性進行預測分析，篩選千人基因組、ESP6500si、ExAC_ALL、Ex-AC_EAS及邁基諾內部1000正常漢族人群數據庫中頻率＜0.05 且預測結果均為致病性的位點作為疾病相關位點。

2 結果

患兒10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子存在c.987delC 純合錯義突變（p.Tyr329fs），即CYP17A1 基因第987 位缺失C，導致氨基酸合成時329 位酪氨酸移碼突變。見圖1。患兒哥哥和父母都存在c.987delC 雜合錯義突變（p.Tyr329fs），見圖2～4。患兒家系突變分析表明患兒攜帶的CYP17A1基因突變分別來源于父母，見圖5。

圖1 患兒10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖2 患兒父親10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖3 患兒母親10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖4 患兒哥哥10號染色體CYP17A1基因第6外顯c.987delC基因突變情況

圖5 17 OHD患兒的遺傳家系圖

3 討論

17OHD 的發病率為1∶50 000～100 000［5］。17OHD是由于CYP17A1基因突變引起，該基因主要在腎上腺和性腺中表達，定位于10q24.32，包含8個外顯子和7 個內含子，基因全長6.6 kb，其編碼的細胞色素P450催化許多藥物代謝以及膽固醇、類固醇和其他脂類合成，是激素合成途徑中產生黃體酮、鹽皮質激素、糖皮質激素、雄激素和雌激素的關鍵酶［6-7］。CYP17A1 基因變異類型較多，人類基因突變數據庫中已報道100 多例，包括錯義突變、無義突變、缺失突變、插入突變、剪接突變等［8-9］。迄今為止，外顯子6 的P.H373L、P.Y329fs 突變和外顯子8的D487_F489 突變是中國人CYP17A1 基因最常見的突變，該突變在日本、泰國、韓國等亞洲國家均有報道，可能是一種亞洲人群的“祖先效應”，即不同的種族CYP17A1 基因突變不同［9～12］。本例患兒檢測到10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子存在c.987delC 純合錯義突變p.Tyr329fs，分別來自父親和母親的雜合基因突變，為中國人群CYP17A1 基因常見突變類型。

CYP17A1 基因調控17-α 羥化酶/17，20-裂解酶合成，這種酶在類固醇激素的合成中起到以下兩種作用：①17-羥基化反應可催化孕烯酮醇和孕酮羥化，若此酶缺乏可導致DOC、皮質酮和18-羥皮質酮生成增加，上述激素具有鹽皮質激素和糖皮質激素樣作用，可代償患者皮質醇不足，患者出生后無腎上腺皮質不足表現，但過度代償時，鹽皮質激素樣作用導致患者出現低腎素性高血壓，低血鉀表現。②17，20-裂解反應可催化17 羥孕烯酮醇和17 羥孕酮裂解，最終生成性激素，該酶缺乏導致性激素合成不足，引起性腺幼稚、第二性征缺如等［13］。本例患兒表現為低腎素、皮質醇、17-羥孕酮、UFC、DHEA、TT、E2 和A4，高FSH，ALD 正常。17-OHCS 和17-KS 降低提示患者腎上腺皮質功能處于較低狀態，患兒ALD 正常可能因為送檢標本中含有醛固酮前體皮質酮，另一種可能是患者體內殘存17OHD，這與SUN 等［14］報道的醛固酮正常患者相似。MACKENZIE 等［15］認為CYP17A1基因可能通過共同的調節因子影響醛固酮水平，YAMAKITA 等［16］認為醛固酮水平與基因受損程度相關［15-16］。另外，通過文獻檢索未發現LH 降低的患者，因此需根據患兒的年齡和性別判斷LH水平。

17OHD 典型臨床表現為低腎素性高血壓，低鉀血癥，男性假兩性畸形和女性性幼稚，雄激素水平低，黃體生成素、卵泡刺激素增高［17］。CYP17A1 基因的缺陷可分為完全性聯合缺陷型17OHD、部分性聯合缺陷型17OHD（非經典型）和孤立性17，20-碳鏈裂解酶缺陷癥（isolated 17，20-lyase deficiency，ILD），部分性聯合缺陷型17OHD 患者17-α 羥化酶/17，20-裂解酶缺乏程度輕于完全性聯合缺陷型17OHD 患者，因此前者臨床癥狀也較后者輕［18］。完全性聯合缺陷型17OHD 患者最常見，46，XX 患者表現為第二性征不發育、原發閉經、幼稚子宮等，46，XY 患者表現為假兩性畸形、外生殖器女性化、腹腔或腹股溝區睪丸、子宮和卵巢缺如。完全性聯合缺陷型17OHD 患者均有高血壓、低血鉀等典型臨床表現，但有研究表明，10%～15%患者可表現為血壓正常［9，19-20］。部分性聯合缺陷型17OHD 患者因有少量性激素產生，因此46，XX 患者常表現為月經稀發、經期不規律、繼發性閉經、不同程度乳腺發育和陰毛生長，46，XY 患者表現為不完全男性化、陰毛稀少、假兩性畸形［21-22］。ILD 患者保留17-α 羥化酶活性，但17，20-裂解酶活性缺乏，因此表現為尿道下裂、小陰莖、陰囊對裂，血壓、血鉀正常［23］。綜上所述，本例患兒的臨床表現提示患兒屬于完全性聯合缺陷型17OHD。患兒最初被誤診為“雙側腹股溝斜疝”，這是由于46，XY 型患者胚胎期分泌苗勒管激素，導致副中腎管退化，出生后內生殖器男性化，但睪丸常位于腹腔或腹股溝，外生殖器女性化，但陰道常為盲短［24］。基于此，患兒一般診斷較早。患兒其他臨床表型如外生殖器女性化、無子宮、無輸卵管等，均符合17OHD 臨床表現［25］。本例患兒并未出現高血壓和低血鉀，生長發育處于正常水平，且未見腎上腺增生，與一例韓國病例報道［20］中患兒僅表現為血壓、血鉀正常一致。

目前各種精確的分子遺傳學檢測已被用于17OHD 的診斷，大多數患者在青春期被確診，部分輕中度表型通常在中老年被確診。其中二代測序技術（next generation sequencing，NGS）的使用，使得大量的單基因和多基因遺傳性疾病明確診斷。NGS技術具有高通量、速度快、精度高、信息量豐富等優勢，是目前17OHD 最主要的診斷技術之一。但不同的測序方法在基因檢測數目、數據分析速度、檢測成本等方面有很大的差異，因此合適的檢測方法不僅為臨床醫師迅速診斷提供遺傳學依據的同時還可以降低患者診治成本。

17OHD 的治療主要以糖皮質激素替代治療以及對癥治療為主。糖皮質激素主要作用是抑制ACTH，改善雄激素水平，降低DOC 水平。糖皮質激素替代治療可選擇地塞米松、潑尼松和氫化可的松，其中氫化可的松屬于生理性糖皮質激素，具有一定水鈉潴留作用（鹽皮質激素樣作用），因此臨床應用更廣泛［26-29］。為了患兒心理健康應盡早確認性別，早期藥物治療可改變性激素水平。我們給予患兒醋酸潑尼松2.5 mg/晚口服，使患兒獲得正常青春期發育。但人工激素無法替代生理性脈沖分泌及晝夜節律，因此定期隨訪和檢查激素變化對17OHD 患兒的預后至關重要。3 個月治療后患兒血清8AM 的ACTH 43.9 ng/mL、4pM 的ACTH 65.1 ng/mL、LH1.2mIU/mL、FSH 35.9 mIU/mL、E2＜5.00 pg/mL、TT＜2.5 ng/mL、PRL 24.9 ng/mL，提示患兒仍存在低皮質醇、低性腺激素、高促性腺激素，調整為醋酸潑尼松5 mg/口服，將繼續對患兒進行隨訪。此外研究［30］發現，46，XY 患者常在腹腔或腹股溝區發現發育異常的異位睪丸，極易發生惡變，因此需要手術切除異位睪丸。本例患兒于外院誤診為“雙側腹股溝斜疝”，雙側異位睪丸已行手術切除，同時我們建議患兒父母針對患兒外生殖器假兩性畸形可考慮手術矯正。

綜上所述，17OHD 患兒存在10 號染色體CYP17A1 基因第6 外顯子c.987delC（p.Tyr329fs）純合突變，其父母、哥哥均為10 號染色體CYP17A1基因第6 外顯子c.987delC（p.Tyr329fs）雜合突變。17OHD 患兒的外顯子突變來自父母遺傳。17OHD是一類較為罕見的CAH 典型表現為低腎素性高血壓、低鉀血癥、性腺功能異常等，部分患者臨床表現不典型易造成誤診、漏診，臨床診療過程中應從臨床表現、輔助檢查及基因檢測等方面綜合診斷。