慢性睡眠剝奪對大鼠髁突軟骨TGF-β1表達(dá)的影響

趙 琛，劉 陽，崔玉蘭*，白月輝，李明陽

(1.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)院修復(fù)科，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050017)

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders,TMD)是以疼痛、下頜運(yùn)動異常和彈響三大臨床特征為主的口頜面系統(tǒng)的常見病。其致病因素較多，目前臨床認(rèn)為咬合和心理因素是其主要致病因素[1]。有研究認(rèn)為睡眠障礙會對TMD的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生作用，很多患者在診斷為TMD之前都有過不良的睡眠經(jīng)歷[2]。改良多平臺法(modified multiple platform method，MMPM)是一種常用的，操作方便的建立睡眠剝奪的方法，研究證明經(jīng)過慢性睡眠剝奪的動物會變得煩躁、焦慮不安，進(jìn)而引起心理上的應(yīng)激狀態(tài)[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一種調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化、增殖的生長因子，參與了軟骨細(xì)胞生長發(fā)育和修復(fù)改建的過程[4]。然而，TGF-β在慢性睡眠剝奪引起的髁突病理性改變及改建中如何表達(dá)尚未有相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過MMPM法建立大鼠慢性睡眠剝奪模型，研究慢性睡眠剝奪大鼠髁突軟骨中TGF-β1的表達(dá)變化。

1 材 料 與 方 法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 Wistar 大鼠60只，雄性，8周齡，體重(220±10) g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號：SCXK冀2018-004)。大鼠先于河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每天將大鼠放置于水箱中30 min以適應(yīng)水環(huán)境，消除大鼠對于水環(huán)境的恐懼。將60只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組和恢復(fù)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠接受1、2、3、4周睡眠剝奪后處死取材，恢復(fù)組在接受1、2、3、4周睡眠剝奪后籠養(yǎng)1周恢復(fù)睡眠，再處死。

本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會要求。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 兔抗鼠TGF-β1一抗(美國Affinity Biosciences.OH公司)，通用二步法試劑盒(北京中山金橋)，MMPM實(shí)驗(yàn)水箱、對照水箱(自制)，曠場實(shí)驗(yàn)箱(自制)，組織包埋機(jī)(櫻花Tissue-Tek TEC5，美國)，超薄石蠟切片機(jī)(LEICA, 德國)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)、多功能照相顯微鏡(OLYMPUSBX-63，日本)。

1.3慢性睡眠剝奪模型的建立 本實(shí)驗(yàn)選擇MMPM建立慢性睡眠剝奪的大鼠模型。自制長寬高為110 cm×70 cm×40 cm的水箱，水箱內(nèi)置15個6.3 cm直徑，8 cm高的小平臺，每個平臺間隔距離為15 cm。將水箱內(nèi)注滿水，水面低于小平臺下1 cm，水溫保持在(20±2)℃，大鼠在小平臺上可自行進(jìn)食，飲水。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在23～29 ℃，每天日光燈照射12 h后關(guān)燈黑暗12 h。小平臺組每日下午16∶00放入水箱內(nèi)進(jìn)行睡眠剝奪，次日上午10∶00取出放回鼠籠中。對照組與實(shí)驗(yàn)組處理方法相同，區(qū)別于在小平臺上置金屬網(wǎng)，大鼠可在金屬網(wǎng)上自由活動及進(jìn)行睡眠。對照組大鼠由于在小平臺上放置金屬網(wǎng)，允許快速動眼睡眠的發(fā)生，同時排除水環(huán)境等其他因素對實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.4慢性睡眠剝奪評價 所有大鼠在慢性睡眠剝奪結(jié)束后均進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。曠場箱是長寬高為100 cm×50 cm×50 cm的立方體實(shí)驗(yàn)箱，箱壁不透明。箱底分為25個面積相等的正方形格子(邊長20 cm)。在曠場上方固定攝像設(shè)備記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況。實(shí)驗(yàn)時將攝像設(shè)備放置于曠場上方中央記錄大鼠水平活動得分、垂直活動得分。水平得分為跨越一格記1分(三爪及以上)，垂直得分為雙前肢同時離地抬起為1分。保證每一次實(shí)驗(yàn)環(huán)境，如隔音、光強(qiáng)度、濕度、溫度等一致。實(shí)驗(yàn)過程中禁止實(shí)驗(yàn)人員被大鼠看到，抓取等操作輕柔切忌暴力，保持安靜，以免對大鼠行為產(chǎn)生干擾。曠場實(shí)驗(yàn)開始前將大鼠放置于實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)環(huán)境2 min，每只大鼠放入曠場中均面部朝向下方，背對實(shí)驗(yàn)人員，且都放在曠場正中央位置。因大鼠活動度有時間性變化，故實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一選擇中午12∶00時進(jìn)行，每只大鼠僅進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)后用75%酒精棉球擦拭箱底及側(cè)壁，清除大鼠排泄物，徹底干燥(約5 min)，以防止大鼠留下的氣味干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5大鼠TMJ標(biāo)本制取 用過量10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用75%酒精消毒大鼠頭部及頸部，采用斷頸方法處死大鼠。剝離大鼠頭部皮膚后剔除咬肌，顳肌等顳下頜關(guān)節(jié)周圍肌肉，完整取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)(含關(guān)節(jié)窩、關(guān)節(jié)盤、下頜髁突及關(guān)節(jié)囊)。取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)組織塊后置于4%多聚甲醛固定24 h。采用10%乙二胺四乙酸溶液脫鈣1個月(每1～2 d更換一次脫鈣液)，以探針穿刺骨組織無阻力感，可以穿透組織為脫鈣完成標(biāo)準(zhǔn)。

1.6HE染色 脫鈣完成后流水下沖洗過夜，梯度酒精脫水，浸蠟包埋(包埋時注意方向，髁突矢狀向平行于蠟塊底部，髁突外側(cè)朝外)。包埋完成后由關(guān)節(jié)外側(cè)向內(nèi)側(cè)連續(xù)進(jìn)行矢狀向切片，切片厚度為4 μm，37 ℃展片儀撈片，55 ℃烘片2 h備用。石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ液12 min，二甲苯Ⅱ液12 min，無水乙醇2 min，95%乙醇溶液2 min，85%乙醇溶液1 min，75%乙醇溶液1 min，流水沖洗。蘇木素溶液5 min，流水沖洗。鹽酸酒精分化1～2 s，流水沖洗。1%氨水反藍(lán)30 s，流水沖洗。伊紅溶液30 s，流水沖洗。75%乙醇溶液3 min，85%乙醇溶液3 min，95%乙醇溶液10 min，無水乙醇10 min。二甲苯5 min。封片。

1.7免疫組織化學(xué)染色 脫蠟與水化：二甲苯10 min×3次，無水乙醇10 min×3次，95%乙醇溶液3 min×2次，85%乙醇溶液3 min×2次，75%乙醇溶液3 min×2次，蒸餾水沖洗1 min，置于PBS緩沖液溶液中。抗原修復(fù)：將胃蛋白酶溶液滴到載玻片組織上，37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(SP-9001)滴加到載玻片組織上，室溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加一抗：滴加適量一抗(TGF-β1 1∶50)到載玻片的組織上，37 ℃孵育60 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液：將適量反應(yīng)增強(qiáng)液(SP-9001)滴加到載玻片組織上，室溫反應(yīng)20 min。PBS緩沖液沖洗3 min×3次。滴加酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物：將酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物滴加到載玻片的組織上，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次。顯色：配制DAB顯色液，滴加到載玻片組織上，反應(yīng)6 min，鏡下觀察染色。復(fù)染：自來水沖洗，蘇木素染色液染色30 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化1～2 s，流水沖洗，氨水反藍(lán)30 s。脫水，透明，封片：75%乙醇溶液1 min，85%乙醇溶液1 min，95%乙醇溶液10 min，無水乙醇10 min，二甲苯5 min。中性樹膠封片。

1.8圖像采集與分析 利用OlympusBX-63顯微鏡觀察組織，使用顯微鏡配套相機(jī)系統(tǒng)及軟件拍攝圖像。HE染色圖像的照片選取整個髁突表面采集，免疫組織化學(xué)圖像選擇髁突中1/3與后1/3交界處的髁突軟骨(髁突軟骨對應(yīng)關(guān)節(jié)盤中間帶處)，每張切片在該處隨機(jī)截取3個×400倍鏡下的視野(截取部位見圖1)，對所選取的每個區(qū)域中陽性細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行求和，取3個視野平均值作為陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度。

圖1 圖像采集區(qū)域：髁突中1/3與后1/3交界處(SP ×400)

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1曠場實(shí)驗(yàn) 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與恢復(fù)組結(jié)束睡眠剝奪時曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果水平得分和垂直得分均高于對照組(P<0.05)，見表1，2，證明睡眠剝奪建模成功。恢復(fù)組在恢復(fù)睡眠1周后測試曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對照組得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明恢復(fù)組大鼠在恢復(fù)正常睡眠1周后已不再處于應(yīng)激狀態(tài)。

表1 曠場實(shí)驗(yàn)垂直得分Table 1 Vertical score of open field experiment 分)

表2 曠場實(shí)驗(yàn)水平得分Table 2 Level score of open field experiment 分)

2.2軟骨髁突組織結(jié)構(gòu)變化 對照組髁突軟骨表層光滑連續(xù)，表層纖維結(jié)構(gòu)與髁突表面平行，排列緊密。髁突中部纖維軟骨帶約肥大細(xì)胞4～6層，細(xì)胞排列無明顯規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)組的髁突軟骨HE染色，可以觀察到髁突軟骨有增齡性變化，軟骨細(xì)胞層數(shù)隨時間增長而逐漸減少。1周實(shí)驗(yàn)組與對照組髁突軟骨無明顯差別，2周實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分層逐漸變得不清晰，增殖帶的小細(xì)胞有向下侵入圓形軟骨細(xì)胞層的現(xiàn)象發(fā)生。3周實(shí)驗(yàn)組的這種現(xiàn)象更加常見， 4周實(shí)驗(yàn)組還可以觀察到軟骨表層細(xì)胞間發(fā)生裂隙，軟骨深層與軟骨下骨界限不明顯。

恢復(fù)組與實(shí)驗(yàn)組相比，表層纖維帶的裂隙減小，或是部分裂隙被纖維樣組織占據(jù)但內(nèi)部尚無細(xì)胞長入。局部纖維軟骨帶細(xì)胞層數(shù)較周圍明顯增多，但細(xì)胞界限清晰，纖維軟骨帶中的圓形軟骨細(xì)胞增多，層數(shù)增加(圖2～4)。

2.3TGF-β1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 TGF-β1在增殖帶軟骨細(xì)胞和纖維軟骨帶的圓形軟骨細(xì)胞中有陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)包括胞漿與細(xì)胞外基質(zhì)在內(nèi)的棕黃色染色(圖5)。

對照組TGF-β1可見在髁突軟骨增殖層中表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度隨實(shí)驗(yàn)時間的延長并未出現(xiàn)明顯變化，1、2、3、4周組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

實(shí)驗(yàn)組1、2、3、4周組間TGF-β1的表達(dá)隨實(shí)驗(yàn)時間的延長而增多，與相應(yīng)的對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。1周組表達(dá)部位位于增殖層細(xì)胞中，隨睡眠剝奪時間延長，深層肥大軟骨細(xì)胞逐步開始表達(dá)TGF-β1，且染色加深。

恢復(fù)組1、2、3、4周的TGF-β1表達(dá)較相對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組減少(P<0.05)。睡眠剝奪1周恢復(fù)組TGF-β1表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，睡眠剝奪2、3、4周時TGF-β1陽性細(xì)胞較對照組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 TGF-β1在髁突軟骨的陽性細(xì)胞個數(shù) Tab3 The number of positive cells of TGF-β1 in condylar cartilage

3 討 論

研究TMD病理機(jī)制的動物模型有很多，根據(jù)TMD疾病的致病因素，可分為通過改變咬合使關(guān)節(jié)負(fù)荷增大建立TMD模型，通過化學(xué)藥物注射建立TMD模型，通過外科手術(shù)切除關(guān)節(jié)盤建立模型或是通過基因工程等方式建立模型[5]。但隨著對TMD病因中心理因素的深入研究，尤其是睡眠障礙這一病因的探究，需要一種能廣泛應(yīng)用于鼠類這種常用實(shí)驗(yàn)動物的睡眠剝奪模型建立的方法。因此本研究的實(shí)驗(yàn)組采用MMPM建立慢性睡眠剝奪模型的Wistar大鼠模型。MMPM法是一種干擾因素可控，建模效果明顯的睡眠剝奪方法，被廣泛應(yīng)用于研究慢性睡眠剝奪引起動物應(yīng)激狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)[2]。

曠場實(shí)驗(yàn)常用于驗(yàn)證慢性睡眠剝奪模型建立是否成功，曠場實(shí)驗(yàn)可以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)動物自主運(yùn)動行為、焦慮、抑郁程度。本實(shí)驗(yàn)參考已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果參數(shù)進(jìn)行設(shè)定與分析，選擇記錄水平跨格數(shù)、直立次數(shù)綜合考慮評價，已有研究認(rèn)為水平跨格數(shù)、直立次數(shù)的增加，表明實(shí)驗(yàn)動物受睡眠剝奪導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示睡眠剝奪組在相同時間點(diǎn)的行為學(xué)記錄得分均高于對照組，證明慢性睡眠剝奪模型建立成功，對大鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的應(yīng)激刺激。同時本實(shí)驗(yàn)不同于以往研究，設(shè)計恢復(fù)組探討慢性睡眠剝奪成功后對實(shí)驗(yàn)動物恢復(fù)正常睡眠，可否引起不同變化。該組大鼠在完成各時間點(diǎn)的睡眠剝奪后，立即進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明建模成功。恢復(fù)組大鼠在完成睡眠剝奪后恢復(fù)正常睡眠1周，再進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，此時恢復(fù)組大鼠得分與對照組得分相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明大鼠在恢復(fù)1周睡眠后，其應(yīng)激狀態(tài)得到了一定的緩解。

正常的下頜髁突表面由一層纖維軟骨構(gòu)成，根據(jù)軟骨內(nèi)各部分結(jié)構(gòu)的差異，可將髁突軟骨由表面向內(nèi)分為4個帶：纖維帶、增殖帶、纖維軟骨帶和鈣化軟骨帶。纖維帶位于表面排列緊密整齊，纖維走形方向與軟骨表面平行，下層是具有小而密集細(xì)胞的增殖帶，再深層是包含圓形軟骨細(xì)胞的纖維軟骨帶，鈣化軟骨帶位于最深層與軟骨下骨相連。正常情況下各層細(xì)胞界限清楚，結(jié)構(gòu)排列整齊。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過慢性睡眠剝奪，實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突表層纖維出現(xiàn)裂隙、斷裂，細(xì)胞界限不清，軟骨下骨向軟骨層長入等退行性改變，與已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[7-8]。恢復(fù)組與實(shí)驗(yàn)組相比，髁突表層纖維帶裂隙減少，局部肥大細(xì)胞層數(shù)有增加，各層細(xì)胞界限較清晰，說明經(jīng)過1周睡眠恢復(fù)，髁突軟骨退行性改變癥狀有了一定改善。

TGF-β是一類在骨形成和骨改建過程中起重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子，包含 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多個成員，近年來大量實(shí)驗(yàn)證明，TGF-β可在一定程度上促進(jìn)骨的修復(fù)再生[9-11]。TGF-β可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，并控制細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解。有研究認(rèn)為TGF-β在生長發(fā)育期表達(dá)增加，隨著生長發(fā)育停止而逐漸減少[12]。本實(shí)驗(yàn)中對照組中TGF-β1表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，可能與增齡性變化有關(guān)。有研究將關(guān)節(jié)軟骨碎塊化后發(fā)現(xiàn)TGF-β1存在過表達(dá)的現(xiàn)象，且過表達(dá)的TGF-β1能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞遷移,促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)[13]。有學(xué)者利用天然高分子乙烯基之間的化學(xué)作用，制備了TGF-β負(fù)載光聚合殼聚糖/絲蛋白生物水凝膠基質(zhì)，觀察發(fā)現(xiàn)可以有效的促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，認(rèn)為TGF-β可以用于軟骨組織再生[14]。Wiegertjes等[15]通過收集衰老的OA樣關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β可以抑制白細(xì)胞介素6的表達(dá)，減緩關(guān)節(jié)軟骨變性。因此，可以認(rèn)為TGF-β對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展與修復(fù)密切相關(guān)。王軻等[6]認(rèn)為慢性睡眠剝奪引起大鼠應(yīng)激態(tài)后，大鼠髁突微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致局部炎癥因子表達(dá)增加。有研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)節(jié)炎癥初期，軟骨受到輕微損傷引起TGF-β1表達(dá)增加，TGF-β1會增加膠原纖維、蛋白多糖的合成，修復(fù)炎癥因子對微環(huán)境所造成的破壞[16]。而當(dāng)關(guān)節(jié)炎癥發(fā)展到一定程度時，軟骨基質(zhì)進(jìn)一步降解，軟骨細(xì)胞肥大、凋亡，TGF-β在軟骨內(nèi)的合成作用小于分解作用，軟骨組織合成代謝的速度低于分解代謝，最終炎癥向終末發(fā)展[17]。本實(shí)驗(yàn)中，軟骨組織因慢性睡眠剝奪而發(fā)生退行性改變，軟骨細(xì)胞分泌TGF-β1增加。睡眠剝奪初期未能觀察到明顯組織變化，直到剝奪睡眠2～3周時才發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)的退行性，與已有研究一致。在恢復(fù)組中，睡眠剝奪1周恢復(fù)組TGF-β1表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示短時間的睡眠剝奪對髁突的影響可能會隨著睡眠恢復(fù)而很快恢復(fù)。睡眠剝奪2、3、4周恢復(fù)組較實(shí)驗(yàn)組TGF-β1表達(dá)下降可能是因?yàn)殡S著軟骨適應(yīng)性改建需求的下降，TGF-β1分泌減緩所致，但較對照組仍有顯著性增高則表示髁突軟骨依舊處于改建恢復(fù)過程中。恢復(fù)組在HE染色中局部的肥大軟骨細(xì)胞增多，可能是由于TGF-β1對軟骨細(xì)胞的分化增殖有促進(jìn)作用有關(guān)。有研究表明TGF-β1過度表達(dá)會引起軟骨組織的增生，尤其是肥大細(xì)胞的數(shù)量增加[18]。

通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，MMPM可以引起顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的退行性表現(xiàn)，而在此過程中TGF-β1作為一種包含軟骨組織的生長因子產(chǎn)生了重要作用。但本實(shí)驗(yàn)未能從細(xì)胞和分子水平探討其具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。(本文圖見封三)