肺炎支原體肺炎病兒血清長鏈非編碼RNA MALAT1、微小RNA-125b的表達及臨床意義

王秋菊

作者單位：許昌市人民醫院NICU，河南 許昌461000

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneu?monia，MPP）是小兒常見的呼吸道感染，支原體感染不僅引起呼吸道的炎性改變，也可引起全身炎性反應綜合征，甚至導致多器官功能的損害［1-2］。在MPP的進展過程中，炎癥反應及其相關的器官功能損害具有重要的作用。長鏈非編碼RNA MALAT1（Long non-coding RNA MALAT1，LncRNA MALAT1）可通過調控細胞增殖、凋亡等生物學過程從而參與多種疾病發生及發展過程。研究表明，MALAT1 在特異性感染過程中，參與炎癥反應的過程，與病情的進展有關［3-4］。并且能夠通過調控微小RNA-125b（mi?croRNA-125b，miR-125b）的表達從而參與炎癥進展及器官功能損害的過程［5］。本研究就不同病情及病程MPP 病兒血清LncRNA MALAT1、miR-125b 表達情況進行研究，為MPP 病情及預后的評估提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2016 年4 月至2018 年6 月許昌市人民醫院收治的MPP病兒40例（MPP組），其中男23 例，女17 例，年齡（4.56±2.13）歲，范圍為1～8歲。納入標準：（1）MPP 急性期符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015 年版）》［6］中診斷標準；（2）病兒近親屬自愿納入研究。排除標準：（1）合并其他部位感染；（2）合并免疫系統疾病；（3）合并心血管系統畸形或肺結核等其他病原菌感染。病兒病情輕型26 例，重型［7-8］14 例。選擇同期該院體檢的健康兒童40 例作為對照組，男22 例，女18 例，年齡（5.19±3.22）歲，范圍為1～10 歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1標本采集 對照組入組后采集空腹靜脈血3 mL，MPP組病人入組后及治療進入緩解期后分別采集空腹靜脈血3 mL，血液樣本置于離心管內，4 ℃條件下經3 000 r/min離心5 min，分離血清，置于?80 ℃超低溫冰箱保存，分批檢測。

1.2.2 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測LncRNA MALAT1、miR-125b 的表達水平 對照組入組后、病兒入組后及病情進入緩解期后采用Trizol 試劑提取血清中總RNA，應用Nano?drop2000c 超微量分光光度計測定RNA 濃度，根據逆轉錄試劑盒說明書操作將總RNA 逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。MALAT1 正向引物5’-CTTAAGC?GCAGCGCCATTTT-3’，反向引物 5’-CCTC?CAAACCCCAAGACCAA-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGA?AC-3’，反向引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-125b 正向引物5’-ATCACAGGTCAG?GCTCTTGG-3’，反向引物5’-ACGTCAGATAGC?TAGCTCTACG-3’；U6 正向引物5’-ATTGGAAC?GATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAAC?GCTTCACGAATTTG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補足體系至20 μL；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環40 次。置于ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀檢測，LncRNA MALAT1 以GAPDH 為內參，miR-125b 以U6 為內參，采用2?ΔΔCt法LncRNA MALAT1、miR-125b 相對表達量。Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 檢測血清CRP、IL-6 及TNF-α 檢測 病兒及對照組入組后應用P800型全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）檢測血清C 反應蛋白（CRP）水平，檢測方法為比濁法，由該院檢驗科完成檢測；采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測血清白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，檢測試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，檢測過程嚴格按照試劑及儀器使用說明書進行。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0 進行分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關性分析檢驗變量之間的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兒童血清MALAT1、miR-125b 的表達量比較與對照組相比，MPP 組血清MALAT1 的表達水平升高［（2.13±0.16）比（1.00±0.10），t=37.89，P<0.001］，miR-125b 的表達水平降低［（0.52±0.11）比（1.01±0.13），t=18.20，P<0.001］。

2.2 不同病情MPP 病兒血清MALAT1、miR-125b的表達量比較輕癥型MPP 病人血清MALAT1 表達量低于重癥型［（1.62±0.23）比（2.97±0.31），t=15.65，P<0.001］，miR-125b 表達量高于重癥型［（0.77±0.13）比（0.32±0.07），t=12.00，P<0.001］。

2.3 兩組兒童血清CRP、IL-6、TNF-α 水平比較與對照組相比，MPP 組病兒血清CRP、IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05），見表1。

表1 兩組兒童血清CRP、IL-6、TNF-α水平比較/± s

注：CRP 為C 反應蛋白，IL-6 為白細胞介素-6，TNF-α 為腫瘤壞死因子α，MPP為肺炎支原體肺炎。

例數40 40 IL-6/（ng/L）13.21±3.98 35.26±8.52 14.83<0.001組別對照組MPP組t值P值CRP/（mg/L）3.22±1.16 11.16±3.13 15.04<0.001 TNF-α/（ng/L）14.32±4.21 32.31±8.57 11.92<0.001

2.4 MPP 病兒血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表達量與CRP、IL-6、TNF-α的相關性Pearson相關性分析結果顯示LncRNA MALAT1 表達量與CRP、IL-6、TNF-α 呈正相關，miR-125b 的表達量與CRP、IL-6、TNF-α呈負相關（P<0.05），見表2。

表2 MPP病兒40例血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表達量與CRP、IL-6、TNF-α的Pearson相關性分析結果

3 討論

LncRNA MALAT1 是定位于細胞核核小體核斑區的長鏈非編碼RNA，是一個高度保守序列，雖然不具有蛋白編碼功能，但能夠通多多種形式實現對功能蛋白轉錄和轉錄后功能進行調控。LncRNA MALAT1 對細胞的增殖及遷徙能力具有促進作用，在腫瘤的進展及轉移中具有重要作用。miR-125b是內源性的非編碼微小RNA，能夠通過與mRNA 的結合抑制或誘導蛋白的翻譯，進而發揮生物活性作用。近年來的研究發現，miRNA 生物活性作用的發揮不僅包括對mRNA 活性的調節，也包括對Ln?cRNA 的調控作用。在對口腔鱗癌的細胞及動物實驗中發現，LncRNA MALAT1 能夠通過對miR-125b靶點的競爭性結合，促進腫瘤細胞的增殖［9］，在對膿毒血癥等嚴重感染模型的觀察中也發現，miR-125b是LncRNA MALAT1 作用的靶點，LncRNA MALAT1能夠通過對miR-125b 的調控，引起TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17 等炎性遞質表達水平的變化［5］。miR-125b 可通過靶向SPDEF 表達從而抑制過敏性氣道炎癥反應的發生［10］。研究表明miR-125b 可參與單核細胞炎癥反應發生過程，抑制炎性遞質對單核細胞的趨化和激活［11］。在對本組的資料觀察發現，MALAT1 在MPP 病兒中的表達上調，隨著疾病的發展MALAT1 的表達量顯著升高，提示MALAT1表達量升高可能促進MPP 的發生。MPP 病兒血清miR-125b 表達水平降低，而且重型病兒的miR-125b降低得更為明顯。提示miR-125b 表達量降低可能與MMP的進展有關，其表達的下降可能導致氣道的高反應性，進而影響呼吸道的功能及痰液的排出，加重臨床癥狀，在病兒進入緩解期后血清的Ln?cRNAMALAT1 水平降低，而miR-125b 水平升高，提示LncRNAMALAT1與miR-125b在MPP的發生及發展過程中發揮重要調控作用。

研究表明CRP 在全身炎癥綜合征等疾病中的含量增加，在機體感染后CRP 水平明顯升高，其高表達量隨著疾病嚴重程度的增加而顯著升高［12-13］。本研究結果顯示MPP 病兒血清CRP 水平明顯升高，與上述研究結果相似。IL-6、TNF-α 屬于促炎性細胞因子，其水平升高與MPP密切相關［14-17］。

本研究結果顯示MPP 病兒血清IL-6、TNF-α 水平明顯升高，與相關文獻報道結果相似［18］。提示IL-6、TNF-α 水平升高導致的炎癥反應在MPP 的病情進展中具有重要的作用。本研究結果顯示MALAT1表達量與CRP、IL-6、TNF-α 呈正相關，miR-125b 的表達量與CRP、IL-6、TNF-α 呈負相關，提示血清MALAT1、miR-125b 表達與MPP 病兒免疫反應及炎癥反應的發生密切。隨著血清LncRNAMALAT1 水平的升高與miR-125b水平的降低，MPP 病兒感染嚴重程度明顯增加，提示LncRNAMALAT1 與miR-125b 水平變化可通過調控炎癥反應從而參與MPP發生及發展過程。

綜上所述，MPP 病兒血清miR-125b 的表達水平明顯升高，miR-125b 的表達水平明顯降低，二者表達量變化與MPP 病情及進展密切相關，MALAT1 與miR-125b可能作為評估MPP 疾病進展的重要指標。但關于MALAT1 與miR-125b 在MPP 發生及發展過程中的作用機制仍需進一步探討。