長鏈非編碼RNA LINC01419調控結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的機制

陳素華，馬天江，張智慧，張磊，史磊

作者單位：漯河市中心醫院腫瘤科，河南 漯河462000

結直腸癌是全球第三大惡性腫瘤，對人類健康構成重大威脅［1］。據統計，結直腸癌是所有癌癥中發病率第三高的癌癥［2］。結直腸癌由多種因素引起，包括個體遺傳和環境影響。例如，大規模的遺傳學研究發現，結直腸癌的發生與多基因異常表達和多分子相互作用有關［3-4］，但對結直腸癌發生的分子機制的研究并不詳盡。因此，進一步研究結直腸癌的發病機制，可能為開發新的治療策略提供理論依據。最新研究表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）LINC01419在食管鱗狀細胞癌組織和細胞中上調表達，沉默其表達可抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖，促進細胞凋亡［5］。LINC01419在胃癌組織中高表達，干擾其表達抑制胃癌細胞的遷移和侵襲［6］。資料顯示，微小RNA-132-3p（miR-132-3p）在結直腸癌組織和細胞中下調表達，過表達miR-132-3p 抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡［7］。但lncRNA LINC01419 在結直腸癌中的表達及其對結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的影響，且lncRNA LINC01419是否通過靶向調控miR-132-3p 的表達影響結直腸癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲目前還尚未可知。因此，本研究考察lncRNA LINC01419在結直腸癌組織中的表達，以及對結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移侵襲的影響，并結合miR-132-3p，探索lncRNA LINC01419潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑結直腸癌細胞株SW620 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，LINC01419 小干擾RNA si-LINC01419、si-NC、過表達質粒pcDNA、pcDNA-LINC01419、miR-NC、miR-132-3p、anti-miR-NC、anti-miR-123-3p、熒光素酶報告載體購自上海GenePharma 公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白、Bcl-2 相關X（Bax）蛋白、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體購自美國Cellular Signaling Technology 公司，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。1.2 臨床樣本來源收集漯河市中心醫院2015 年10 月至2018 年5 月因結直腸癌手術切除的組織標本20 例，以距離結直腸癌邊緣≥3 cm 的癌旁正常組織標本20 例為對照。所有病例經病理學確診為結直腸癌，術前未行任何放、化療。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，獲得病人或其近親屬的知情同意書。樣本取材后迅速置于液氮中凍存，用于lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 水平的檢測。

1.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 表達結直腸癌組織和癌旁組織的總RNA 使用TRIzol 試劑獲得，逆轉錄制備互補DNA（cDNA），以cDNA 為模板，進行qRT-PCR 反應。引物序列為：ln?cRNA LINC01419 正 向 5′-GAAACTCCGAACA?CATCTG-3’，反向5′-TTCTCCTGCTGGTTGATT-3′，miR-132-3p正向5′-GCGCGCGTAACAGTCTACAGG-3′，反向5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC-3′。ln?cRNA LINC01419 和miR-132-3p 表達根據2?ΔΔCt方法計算。

1.4 細胞培養與轉染SW620 細胞在DMEM 培養基中（含10%胎牛血清），于培養箱（37 ℃、5%二氧化碳、飽和濕潤）生長。SW620 細胞轉染時，將其接種至6 孔板。依照Lipofectamine 2000 試劑操作指示，在達約70% 密度時將si-LINC01419、pcDNALINC01419、miR-132-3p、anti-miR-123-3p 和各自陰性對照轉染入SW620細胞，轉染48 h。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖將SW620細胞接種于96 孔板（1×104個），分別培養24 h、48 h、72 h 后，與100 μL MTT 溶液反應，4 h 后將結晶用二甲基亞砜溶解，在酶標儀檢測SW620 細胞的吸光度值，波長為490 nm。

1.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白表達利用RIPA 裂解液獲得SW620 細胞的蛋白，吸取30μg 蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將其轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，經5%脫脂牛奶封閉后，4 ℃加入cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白抗體（均為1∶1 000 稀釋）孵育，次日加入二抗孵育2 h，顯色、顯影，以GAPDH為內參，分析蛋白條帶灰度值。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡SW620 細胞（1×105個）的凋亡按照細胞凋亡檢測試劑盒操作指示進行，置于流式細胞儀監測細胞凋亡情況。

1.8 Transwell 檢測細胞遷移、侵襲采用無血清DMEM 培養基調整SW620 細胞密度為1×105個/毫升，并加入Transwell 上室（細胞侵襲實驗時Tran?swell 上室以Matrigel 膠包被，而細胞遷移實驗未使用Matrigel 膠），下室加入500 μL 含血清的DMEM。孵育24 h后，結晶紫染色，顯微鏡下拍照計數。

1.9 生物信息學預測和雙熒光素酶報告實驗LncBasePredicted v.2 對LINC01419 和miR-132-3p的結合進行預測。構建包含miR-132-3p 結合位點的LINC01419 野生型（WT-LINC01419）和突變型（MUT-LINC01419）報告基因載體，并分別與miR-132-3p 或miR-NC 共轉染SW620 細胞，48 h 后檢測細胞熒光素酶活性。

1.10 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計處理，計量資料表示為±s。采用t檢驗比較兩組間數據差異，采用單因素方差分析比較多組數據間差異，使用SNK 法進行組間多重比較，吸光度采用兩因素析因設計方差分析，認為P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA LINC01419 和miR-132-3p 在結直腸癌組織中的表達qRT-PCR 檢測數據顯示，與癌旁組織比較，結直腸癌組織中lncRNA LINC01419表達量明顯增加［（2.74±0.26）比（1.00±0.09），t=28.28，P<0.001］，miR-132-3p 表達量顯著減少［（0.51±0.05）比（1.01±0.08），t=23.70，P<0.001］。

2.2 干擾lncRNA LINC01419 對結直腸癌細胞SW620 增殖的影響時間因素、分組因素均對吸光度有影響，且時間與分組交互條件下對吸光度仍有影響。 在結直腸癌細胞SW620 中轉染si-LINC01419，其表達量明顯低于si-NC 組（P<0.05）。MTT 檢測結果發現，與si-NC 組比較，si-LINC01419明顯降低SW620細胞24 h、48 h、72 h的細胞活性（P<0.05）。蛋白質印跡法檢測結果表明，與si-NC組比較，si-LINC01419 顯著減少SW620 細胞中cyclin D1和P21蛋白表達量（P<0.05）。見表1，圖1。

表1 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖的影響/± s

表1 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖的影響/± s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A。

組別si-NC si-LINC01419 t值P值P21蛋白0.23±0.03 0.61±0.06 16.99<0.001重復次數LINC01419 1.01±0.11 0.48±0.05 13.16<0.001吸光度（490 nm）48 h 0.71±0.06 0.47±0.04 9.98<0.001 24 h 0.39±0.03 0.36±0.03 2.13 0.049 72 h 1.08±0.09 0.62±0.06 12.76<0.001 cyclin D1蛋白0.72±0.06 0.32±0.03 17.89<0.001 99

圖1 蛋白質印跡法檢測兩組結直腸癌細胞SW620增殖相關蛋白表達結果

2.3 干擾lncRNA LINC01419 對結直腸癌細胞SW620 凋亡的影響流式細胞術檢測結果顯示，與si-NC 組比較，si-LINC01419明顯增加SW620細胞凋亡率（P<0.05）。蛋白質印跡法檢測結果發現，與si-NC 組比較，si-LINC01419 顯著降低SW620 細胞中Bcl-2 蛋白水平，并提高Bax 蛋白表達量（P<0.05）。見表2，圖2。

表2 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620凋亡的影響/± s

表2 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620凋亡的影響/± s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X。

組別si-NC si-LINC01419 t值P值重復次數Bax蛋白0.36±0.03 0.79±0.07 16.94<0.001 99凋亡率/%7.12±0.71 20.65±2.01 19.04<0.001 Bcl-2蛋白0.67±0.06 0.26±0.03 18.34<0.001

圖2 蛋白質印跡法檢測兩組結直腸癌細胞SW620凋亡相關蛋白表達結果

2.4 干擾lncRNA LINC01419 對結直腸癌細胞SW620 遷移、侵襲的影響Transwell 檢測結果表明，與si-NC 組比較，si-LINC01419 明顯降低SW620細胞的遷移細胞數和侵襲細胞數（P<0.05）。蛋白質印跡法檢測結果顯示，與si-NC 組比較，si-LINC01419 明顯減少SW620 細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達量（P<0.05）。見表3；圖3，4。

表3 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620遷移、侵襲的影響/± s

表3 干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620遷移、侵襲的影響/± s

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

組別si-NC si-LINC01419 t值P值MMP-9蛋白0.64±0.06 0.25±0.03 17.44<0.001重復次數99遷移細胞數/個106.32±10.24 49.57±5.84 14.44<0.001侵襲細胞數/個84.65±8.48 38.65±4.25 14.55<0.001 MMP-2蛋白0.81±0.07 0.39±0.03 16.54<0.001

圖4 蛋白質印跡法檢測兩組結直腸癌細胞SW620遷移侵襲相關蛋白表達結果

2.5 miR-132-3p 過表達對結直腸癌細胞SW620 增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響時間因素、分組因素均對吸光度有影響，且時間與分組交互條件下對吸光度仍有影響。在SW620 細胞中轉染miR-132-3p，發現相比于miR-NC 組，miR-132-3p 的表達量顯著升高（P<0.05）。與miR-NC 組比較，miR-132-3p 對SW620 細胞24 h 的細胞活性無明顯影響，明顯降低48 h、72 h 的細胞活性（P<0.05），并增加細胞凋亡率（P<0.05），減少遷移細胞數和侵襲細胞數（P<0.05），以及降低cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白水平，增加P21、Bax 蛋白表達量（P<0.05）。見表4，5；圖5。

表4 miR-132-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響/± s

表4 miR-132-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響/± s

組別miR-NC miR-132-3p t值P值重復次數吸光度（490 nm）99 miR-132-3p 1.01±0.09 2.47±0.24 17.09<0.001 24 h 0.41±0.04 0.39±0.03 1.20 0.247 48 h 0.73±0.06 0.57±0.05 6.15<0.001 72 h 1.06±0.09 0.71±0.06 9.71<0.001凋亡率/%6.58±0.66 18.46±1.84 18.23<0.001遷移細胞數/個109.47±11.25 58.97±5.32 12.17<0.001侵襲細胞數/個87.14±8.21 49.64±5.57 11.34<0.001

2.6 lncRNA LINC01419 靶向調控miR-132-3p 的表達利用LncBase Predicted v.2 工具預測發現，LINC01419的序列中含有與miR-132-3p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-132-3p 明顯降低WT-LINC01419 熒光素酶活性［（0.41±0.04）比（1.00±0.09），t=17.97，P<0.001］，而MUT-LINC01419 熒光素酶活性的差異無統計學意義［（1.01±0.07 比1.03±0.08），t=0.56，P=0.580］。pcDNA 組、pcDNA-LINC01419 組、si-NC 組、si-LINC01419組miR-132-3p表達量比較F=294.973，P<0.001；與pcDNA 組（1.00±0.09）比較，pcDNALINC01419 明顯減少miR-132-3p 表達量（0.48±0.04）；與si-NC 組（1.01±0.08）比較，si-LINC01419 顯著提高miR-132-3p表達量（2.25±0.23）。

2.7 抑制miR-132-3p 表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419 對結直腸癌細胞SW620 增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用時間因素、分組因素均對吸光度有影響，且時間與分組交互條件下對吸光度仍有影響。與si-NC 組比較，si-LINC01419明顯增加SW620細胞中miR-123-3p表達量、凋亡率、P21、Bax 蛋白表達量（P<0.05），對24 h的細胞活性無顯著影響，而明顯降低48 h、72 h 的細胞活性、遷移細胞數、侵襲細胞數以及cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9 蛋白表達量（P<0.05）。與si-LINC01419 和anti-miR-NC 共轉染比較，si-LINC01419 和anti-miR-123-3p 共轉染顯著減少SW620 細胞中miR-123-3p 表達量、凋亡率、P21、Bax蛋白表達量（P<0.05），對24 h的細胞活性無顯著影響，并明顯提高48 h、72 h 的細胞活性、遷移細胞數、侵襲細胞數以及cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白水平（P<0.05）。見表6，7；圖6。

表5 miR-132-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響/± s

表5 miR-132-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響/± s

注：cyclin D1 為細胞周期蛋白D1，P21 為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤-2，Bax 為Bcl-2 相關X，MMP-2 為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

MMP-9蛋白0.63±0.06 0.29±0.03 15.21<0.001組別miR-NC miR-132-3p t值P值重復次數99 cyclin D1蛋白0.71±0.07 0.35±0.03 14.18<0.001 P21蛋白0.22±0.03 0.58±0.05 18.52<0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.31±0.03 16.99<0.001 Bax蛋白0.35±0.03 0.74±0.06 17.44<0.001 MMP-2蛋白0.83±0.08 0.42±0.04 13.75<0.001

表6 抑制miR-132-3p表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用/± s

表6 抑制miR-132-3p表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用/± s

注：①與si-NC組比較，P<0.05。②與si-LINC01419+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別si-NC si-LINC01419 si-LINC01419+anti-miR-NC si-LINC01419+anti-miR-123-3p F值P值侵襲細胞數/個86.32±8.24 39.68±4.12①36.77±4.01 71.25±7.01②140.95<0.001重復次數miR-123-3p 1.00±0.08 2.25±0.22①2.31±0.24 1.38±0.13②117.13<0.001吸光度（490 nm）24 h 0.40±0.04 0.37±0.03 0.36±0.03 0.38±0.03 2.44 0.082 48 h 0.74±0.06 0.51±0.05①0.46±0.04 0.62±0.06②49.35<0.001 72 h 1.07±0.09 0.66±0.06①0.61±0.06 0.92±0.08②78.58<0.001凋亡率/%7.74±0.77 22.14±2.25①24.31±2.41 13.69±1.41②157.50<0.001遷移細胞數/個108.46±9.98 51.36±5.28①48.79±5.18 88.22±8.36②135.82<0.001 9999

3 討論

結直腸癌被認為是人類腫瘤病死率最高的腫瘤之一。在中國，結直腸癌的發病率和病死率呈上升趨勢。近年來，結直腸癌的聯合治療得到了改善，包括手術切除、放療和放化療，然而，晚期結直腸癌病人的預后仍然很差［8］。此外，癌細胞的轉移也是治療失敗的最常見原因。因此，探討和了解結直腸癌發生發展的機制，發掘相關的診斷和預后的生物標志物，準確監測結直腸癌的發展，是一個具有特殊意義和緊迫性的問題［9］。

既往研究表明，lncRNA 在許多生物學過程中發揮著重要的作用，如腫瘤血管生成、細胞遷移、細胞凋亡和耐藥性，與癌癥的發生密切相關［10-11］。ln?cRNA 可能作為致癌基因或抑癌基因在結直腸癌中發揮關鍵作用［12-14］。資料顯示，LINC01419 在肺腺癌細胞中表達上調，敲低其表達抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表現出對肺腺癌的致癌能力［15］。LINC01419的沉默可以有效抑制食管鱗狀細胞癌的細胞增殖，并促進細胞凋亡［5］，也可抑制胃癌細胞遷移侵襲［6］。 但目前沒有研究證明lncRNA LINC01419是否是參與結腸直腸癌進展的一個重要角色。本研究數據顯示，LINC01419 在結直腸癌組織中表達上調，提示LINC01419 可能調控結直腸癌的發生發展。在結直腸癌SW620 細胞中轉染si-LINC01419，觀察到干擾lncRNA LINC01419 明顯抑制SW620 細胞24 h、48 h、72 h 的細胞活性、遷移細胞數和侵襲細胞數，而提高細胞凋亡率，并且顯著影響增殖、凋亡、遷移侵襲相關蛋白cyclin D1、P21、Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9 蛋白表達。這些結果表明，lncRNA LINC01419 在結直腸癌中可能充當致癌基因，干擾LINC01419對結直腸癌細胞增殖、遷移侵襲具有抑制作用，對細胞凋亡具有促進作用，與前人研究相符，也為其在結直腸癌中的研究提供了新的資料。

微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一類高度保守的非編碼RNA，miRNA 已被證明參與結直腸癌等癌癥的發生發展過程［16-18］。本實驗數據顯示，與癌旁組織比較，結直腸癌組織中miR-132-3p 表達下調，這與miR-132-3p 在膀胱癌組織中表達下調［19］的結果一致。既往研究發現，與癌旁組織相比，miR-132-3p 在乳腺癌組織中低表達，可抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲［20］，miR-132-3p 能抑制骨肉瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡［21］。本研究功能實驗結果表明，miR-132-3p 過表達可以降低結直腸癌細胞48 h、72 h 的細胞活性、遷移細胞數、侵襲細胞數，并增加細胞凋亡率，顯示出抗癌活性，與Zhang 等［7］的研究一致。生物信息學結合雙熒光素酶報告檢測證實ln?cRNA LINC01419 靶向調控miR-132-3p 的表達，另外，抑制miR-132-3p 表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖、遷移、侵襲的抑制作用，以及逆轉了對細胞凋亡的促進作用。上述結果證明，靶向調控miR-132-3p表達可能是ln?cRNA LINC01419 影響結直腸癌細胞增殖、遷移侵襲、凋亡的重要途徑之一。

表7 抑制miR-132-3p表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的作用/± s

表7 抑制miR-132-3p表達逆轉了干擾lncRNA LINC01419對結直腸癌細胞SW620增殖、凋亡、遷移、侵襲相關蛋白表達的作用/± s

注：cyclin D1 為細胞周期蛋白D1，P21 為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，Bcl-2 為B 細胞淋巴瘤-2，Bax 為Bcl-2 相關X，MMP-2 為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。①與si-NC組比較，P<0.05。②與si-LINC01419+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

MMP-9蛋白0.65±0.06 0.23±0.03①0.22±0.03 0.54±0.05②217.22<0.001組別si-NC si-LINC01419 si-LINC01419+anti-miR-NC si-LINC01419+anti-miR-132-3p F值P值重復次數9999 cyclin D1蛋白0.73±0.07 0.31±0.03①0.29±0.03 0.61±0.06②168.12<0.001 P21蛋白0.24±0.03 0.62±0.06①0.63±0.06 0.36±0.03②150.50<0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.27±0.03①0.26±0.03 0.56±0.05②202.44<0.001 Bax蛋白0.34±0.03 0.77±0.06①0.78±0.07 0.41±0.04②177.27<0.001 MMP-2蛋白0.84±0.07 0.38±0.03①0.37±0.04 0.71±0.06②183.82<0.001

綜上所述，lncRNA LINC01419 在結直腸癌組織中表達上調，干擾其表達能抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，其作用機制與靶向調控miR-132-3p 表達有關，這對于LINC01419、miR-132-3p 在包括結直腸癌在內的諸多癌癥中的治療和預后價值研究具有極其重要的意義。

（本文圖3，5，6見封三）