下調微小RNA-183表達對腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞增殖凋亡的影響及機制

閆凡，黃彩虹

作者單位：榆林市第一醫院小兒二科，陜西 榆林718000

腎母細胞瘤又稱為Wilms 瘤，其作為一種胚胎惡性腫瘤在兒童中最為常見［1］。腎母細胞瘤的病因尚不清楚，其中基因表達改變是其發生的重要原因［2］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一種非編碼的RNA，參與細胞分化、胚胎發育和疾病發生［3-4］。miR-183 是近些年來發現的腫瘤促進因子，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達上調，人為的干擾miR-183表達可以抑制腫瘤細胞的惡性表型［5-7］。現階段對于miR-183在腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡中的作用還不明確。本次實驗于2018 年12月至2019 年7 月采用細胞轉染的方法下調腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞中miR-183 的表達水平，探討下調miR-183對腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡的影響及機制，以期為靶向基因治療腎母細胞瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞購自上海哈靈生物科技有限公司；miR-183 抑制劑（inhibitor）、抑制劑陰性對照（inhibitor control）、miR-183 模擬物（mimics）和模擬對照序列（mimics control）由吉滿生物科技（上海）有限公司合成；噻唑藍（MTT）和膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；程序性細胞死亡4（programmde cell death 4，PDCD4）抗體購自美國Abcam；引物由南京金斯瑞合成；熒光素酶報告載體由西安淳風生物科技有限公司構建；活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗體購自美國Sigma-Aldrich；PDCD4 小干擾RNA（si-PDCD4）、小干擾RNA 陰性序列（si-NC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 細胞轉染采用轉染試劑Lipofectamine 2000分別將miR-183 inhibitor 和inhibitor control 轉染到腎母細胞瘤SK-NEP-1細胞中，具體操作步驟同轉染試劑說明書。設置轉染miR-183 inhibitor 和inhibi?tor control 后的腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞為AntimiR-183 組、Anti-NC 組，設置沒有轉染的細胞為對照組。

1.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測miR-183 表達收集培養48 h 以后的對照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細胞，然后在細胞內添加Trizol 試劑，提取細胞中總RNA。然后逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。PCR 引物序列如下，miR-183 正向引物：5’-AGUGAAUUCUACCAG UGC?CAUA 3’，反向引物：5’-UAUGGCACUGGUAGA AUUCACU3’；U6正向引物：5’CTCGCTTCGGCAGC?CACA3’，反向引物：5’AACGCTTCACGAATTGC?GT3’。使用SYBR Green 進行qRT-PCR，PCR 反應程序設置為：95 ℃反應2 min；95 ℃反應10 s；60 ℃反應30 s，后兩步設置45個循環，U6為內參，結果用2?ΔΔCt法計算。

1.4 MTT 法測定細胞增殖能力按照對照組、An?ti-NC 組、Anti-miR-183 組細胞分組方法將細胞種植到96 孔板中，37 ℃培養2 d，加5 g/L 的MTT，培養4 h。然后將上清吸棄，加二甲基亞砜，置于酶標儀上檢測波長為490 nm的吸光度。

1.5 平板克隆實驗測定細胞克隆能力把對照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細胞接種到平皿內，培養14 d，觀察出現細胞克隆。以甲醇固定10 min，使用0.2%的結晶紫染色，將平皿放在倒置顯微鏡下計數≥50 個細胞的克隆團數目，隨機選擇5 個視野，計算均值。

1.6 流式細胞術測定細胞凋亡水平收集培養48 h 以后的對照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細胞，每組收集106個，將細胞懸浮在300 μL 的結合緩沖液中，將Annexin V-FITC 和PI 工作液添加到細胞中，再加入200 μL 的結合緩沖液，置于避光條件下結合反應15 min，在1 h內使用流式細胞儀測定凋亡情況。

1.7 蛋白質印跡法（Western blotting）測定細胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達收集培養48h 以后的對照組、Anti-NC 組、Anti-miR-183 組細胞，提取細胞總蛋白。將等體積2×上樣緩沖液添加到蛋白樣品中，煮沸5 min。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），每孔上樣30μg 蛋白，電泳2 h后關閉電源。使用轉膜裝置把凝膠上的蛋白電轉移到NC 膜上，轉膜條件為4 ℃，轉膜電流為400 mA。NC 膜放在封閉液中結合1 h，將NC 膜放在cleaved-caspase-3 抗體孵育液中，在4 ℃過夜。NC膜置于二抗反應液中結合2 h。ECL發光，掃描條帶灰度值，內參設置為β肌動蛋白（β-actin）。

1.8 靶基因預測和鑒定在線靶基因預測軟件TargetScan 發現PDCD4 的3′非翻譯區（3’UTR）端與miR-183 有互補結合位點，構建含有PDCD4 的3’UTR 端的PDCD4 野生型熒光素酶報告載體（WT），同時構建突變之后的突變型熒光素酶報告載體（MUT），利用Lipofectamine 2000 把WT 和MUT 分別與mimics control、miR-183 mimics 共轉染到腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞中，48 h 后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測細胞熒光素酶活性變化。

1.9 si-PDCD4 對下調miR-183 的細胞增殖、克隆和凋亡影響將Anti-miR-183 與si-NC、Anti-miR-183 與si-PDCD4 共轉染到腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞中，記為Anti-miR-183+si-NC 組和Anti-miR-183+si-PDCD4組，參照上述MTT 法、平板克隆、流式細胞術以及蛋白質印跡法測定細胞增殖、克隆、凋亡和cleaved-caspase-3、PDCD4蛋白表達水平。

1.10 統計學方法用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-183 inhibitor 抑制腎母細胞瘤細胞中miR-183 表達對照組、Anti-NC 組和Anti-miR-183組腎母細胞瘤細胞中miR-183 表達水平分別為（1.00±0.09）、（0.98±0.11）和（0.32±0.04）（F=61.82，P<0.001）。與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細胞瘤細胞中miR-183 水平降低（P<0.05），對照組差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 下調miR-183 對腎母細胞瘤細胞增殖、克隆和凋亡影響與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細胞瘤細胞增殖、克隆能力下降（P<0.05），細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）；對照組各檢測指標均差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1，表1。

表1 miR-183抑制劑（inhibitor）轉染后腎母細胞瘤細胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平變化/± s

表1 miR-183抑制劑（inhibitor）轉染后腎母細胞瘤細胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）蛋白水平變化/± s

注：①與Anti-NC組比較，P<0.05。

組別對照組Anti-NC組Anti-miR-183組F值P值cleaved-caspase-3 0.28±0.03 0.27±0.04 0.69±0.09①48.76<0.001重復次數333吸光度0.39±0.05 0.40±0.03 0.20±0.02①30.08 0.001克隆形成數目/個314.58±23.85 312.87±22.28 213.69±20.94①19.97 0.002凋亡率/%2.45±0.21 2.36±0.32 16.47±1.58①224.56<0.001

圖1 蛋白質印跡法檢測三組腎母細胞瘤細胞cleaved-caspase-3蛋白表達

2.3 miR-183 與PDCD 靶向關系預測和鑒定在線靶基因預測軟件預測的PDCD4 的3’UTR 端與miR-183 互補的結合位點見圖2。共轉染WTPDCD4 與miR-183 mimics 的腎母細胞瘤細胞熒光素酶活性為（0.36±0.04），顯著低于共轉染WTPDCD4 與mimics control 的細胞（1.00±0.12）（t=9.47，P<0.001）；共轉染MUT-PDCD4 與miR-183 mimics 的腎母細胞瘤細胞熒光素酶活性為0.98±0.10，與共轉染MUT-PDCD4 與mimics control 的細胞比較差異無統計學意義（1.00±0.12）（t=0.22，P=0.835），說明miR-183靶向結合PDCD4。

圖2 在線靶基因預測軟件TargetScan預測的程序性細胞死亡4（PDCD4）的3′非翻譯區（3’UTR）端與miR-183互補的結合位點

2.4 下調miR-183 對腎母細胞瘤細胞中PDCD4 蛋白表達影響對照組、Anti-NC 組和Anti-miR-183 組腎母細胞瘤細胞中PDCD4 蛋白水平分別為（0.36±0.04）、（0.37±0.06）和（0.89±0.07）（F=81.89，P<0.001）。與Anti-NC 組比較，Anti-miR-183 組腎母細胞瘤細胞中PDCD4 蛋白水平升高（P<0.05），對照組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 蛋白質印跡法檢測三組腎母細胞瘤細胞PDCD4蛋白表達

2.5 si-PDCD4 對下調miR-183 的腎母細胞瘤細胞增殖、克隆和凋亡的逆轉作用與Anti-miR-183+si-NC 組比較，Anti-miR-183+si-PDCD4 組腎母細胞瘤細胞增殖和克隆能力升高，細胞凋亡減少，細胞中cleaved-caspase-3、PDCD4 蛋白表達水平下降（均P<0.05），見表2。

表2 程序性細胞死亡4（PDCD4）小干擾RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制劑（inhibitor）共轉染后腎母細胞瘤細胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平變化/± s

表2 程序性細胞死亡4（PDCD4）小干擾RNA（si-PDCD4）和miR-183抑制劑（inhibitor）共轉染后腎母細胞瘤細胞增殖能力（吸光度）、克隆形成數目、凋亡率和活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）、PDCD4蛋白水平變化/± s

組別Anti-miR-183+si-NC組Anti-miR-183+si-PDCD4組t值P值重復次數33吸光度0.21±0.03 0.32±0.04 3.81 0.019克隆形成數目/個216.20±13.68 286.47±20.65 4.91 0.008凋亡率/%17.93±1.64 10.79±1.28 5.95 0.004 cleaved-caspase-3 0.72±0.08 0.30±0.03 8.51<0.001 PDCD4 0.86±0.09 0.45±0.05 6.90 0.002

3 討論

腫瘤發生與腫瘤細胞失控性生長有關，是一個多步驟、復雜過程，在腫瘤進展中，癌基因表達上調和抑癌基因表達下調均可以誘導腫瘤惡性進展［8］。miRNA 是廣泛存在于真核生物體內的單鏈RNA，其可以通過影響基因轉錄后表達而參與細胞的生長過程［9］。多項研究顯示，miRNA與腫瘤的進展有關，參與調控腫瘤生長、凋亡等生物學特性發揮過程，在腫瘤進展中發揮類似癌基因或抑癌基因的作用［10-11］。miR-183在進化上高度保守，可以通過影響腫瘤相關基因的表達調控腫瘤的發展［12］。在肺癌中發現miR-183可以作為一種腫瘤促進因子誘導肺癌的生長［13］。還有研究報道，在肝癌、前列腺癌等腫瘤組織中發現miR-183 的促腫瘤生長作用，其被認為是一種腫瘤促進因子［14-15］。本次實驗表明，下調miR-183后的腎母細胞瘤細胞增殖和克隆能力下降，提示下調miR-183 具有抑制腎母細胞瘤細胞惡性生長的作用。

本研究結果還顯示，下調miR-183 后的腎母細胞瘤細胞凋亡水平升高，細胞中cleaved-caspase-3蛋白水平也升高。胱天蛋白酶（caspase）蛋白家族含有十幾個家族成員，主要存在于細胞質中，是目前發現的與細胞凋亡有關的調控因子［16］。caspase蛋白家族成員在凋亡反應中發揮起始因子、執行因子等不同作用，并且正常情況下以酶原形式存在的caspase 蛋白家族成員不具備活性，只有被激活后才可以誘導細胞凋亡發生［17］。cleaved-caspase-3 是胱天蛋白酶-3（caspase-3）的活化形式，caspase-3 是凋亡反應的執行因子，位于凋亡級聯反應的下游，其活化后是細胞凋亡進入不可逆階段的標志［18］。本次結果顯示，下調miR-183 促進腎母細胞瘤細胞中cleaved-caspase-3 蛋白表達，進一步說明下調miR-183誘導腎母細胞瘤細胞凋亡。

miRNA 具有多種生物學作用，其生物學作用的發揮與調控細胞內靶基因的表達有關［19］。研究表明，miR-183 作用機制與靶向調控多個靶基因有關，并且其在不同的病理過程中調控的靶基因不同［20］。本次實驗顯示，PDCD4 是miR-183 的靶基因，miR-183 作用機制在腎母細胞瘤細胞中的作用機制可能與PDCD4 有關。PDCD4 是一個與細胞凋亡有關的腫瘤抑制因子，在腫瘤組織中表達下調，上調PDCD4 可以誘導腫瘤細胞凋亡和增殖抑制［21］。本研究證實，下調PDCD4 可以逆轉下調miR-183 對腎母細胞瘤細胞增殖抑制和凋亡促進作用，提示下調miR-183通過靶向調控PDCD4的表達影響腎母細胞瘤細胞增殖和凋亡。

總之，下調miR-183 可以阻礙腎母細胞瘤細胞惡性生長，促進細胞凋亡，并且其作用機制與靶向調控PDCD4 的表達有關，靶向抑制miR-183 可能是腎母細胞瘤治療的途徑，miR-183 在腎母細胞瘤中可能發揮促進作用。在以后的實驗中會在多株腎母細胞瘤細胞中進行驗證，并對其具體的調控機制進行探討。