宮頸癌病人切除修復交叉互補基因1基因多態性與鉑類超敏反應關系

侯麗娟，王文文，翟建軍，孫燕

作者單位：首都醫科大學附屬北京同仁醫院婦產科，北京100176

多數宮頸癌病人確診時病情已進展至晚期，單純手術及放療難以控制，需聯合新輔助化療［1］。鉑類是宮頸癌化療中最基礎藥物，可結合癌細胞DNA堿基產生交聯反應，干擾DNA 復制，抑制腫瘤生長，然而仍有部分病人化療不敏感，預后較差［2-3］。近年研究發現，DNA 損傷修復能力異常是鉑類耐藥重要分子基礎［4］。在人類細胞中，化療藥物及紫外線所致DNA 損傷主要通過核苷酸剪切修復途徑（nucleo?tide excision repair，NER）修復，而切除修復交叉互補基因1（excision repair cross complement 1，ERCC1）在NER 途徑中起著關鍵作用，如NER 初期發揮DNA 損傷識別功能，后期共同行使損害部位5，端切除功能［5］。因此宮頸癌病人ERCC1 基因多態性與鉑類超敏反應關系的研究成為當前研究熱點。本研究旨在宮頸癌病人分析ERCC1 基因多態性與鉑類超敏反應關系，明確鉑類超敏反應危險因素，為臨床確定合理化療方案提供參考信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012 年1 月至2017 年9 月首都醫科大學附屬北京同仁醫院收治的103例宮頸癌病人作為研究對象，均經細胞病理學檢查確診。年齡（42.51±10.68）歲，范圍為20～65 歲。病人或其近親屬知曉并簽署知情同意書，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法所有病人化療前后均接受肝腎功能、外周血細胞、心電圖等常規檢查。35 例接受PBF 方案，d1～d5，靜脈滴注20 mg/m2順鉑，肌內注射500 mg/m25-氟尿嘧啶，d1、d5，肌內注射博來霉素7 mg/m2；33 例接受PMF 方案：d1～d5，靜脈滴注0.75～1.00 g/m25-氟尿嘧啶，d1，靜脈滴注6～8 mg/m2絲裂霉素，d1～d3，靜脈滴注40 mg 順鉑；38 例接受PVB 方案：d1、d2，靜脈滴注40 mg 順鉑，d1，靜脈滴注30 mg 長春新堿，d2，靜脈滴注博來霉素30 mg；21 d 為1 個化療周期，連續化療1～2個周期后評估，化療有效且分期較晚者，建議放療；化療有效且分期較早者行盆腔淋巴結及根治性子宮切除術，若術后病理結果顯示切緣陽性、低分化癌、淋巴結轉移等高危因素，給予以放療為主的輔助治療。

化療后切除或活檢腫瘤組織，?80 ℃超低溫冰箱內保存待測。（1）DNA提取：取血液標本200μL置于離心管，滴加蛋白酶K 溶液20μL、緩沖液20μL，充分混合均勻，56 ℃放置15 min，直至溶液清亮；滴加無水乙醇200μL，振蕩混勻，倒入硅膠離心柱，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管；于硅膠離心柱滴加緩沖液500μL，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管；于硅膠離心柱滴加漂洗液500μL，離心30 s，倒掉廢液，將硅膠離心柱放回收集管，離心2 min，倒掉廢液，室溫下放置數分鐘，晾干吸附材料中殘余漂洗液；將硅膠離心柱轉入干凈離心管，滴加洗脫緩沖液100 μL，室溫放置15 min，離心2 min，離心管收集溶液。（2）聚合酶鏈式反應（PCR）：反應體系為2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物2 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水8.5 μL，總體積25μL；引物序列：ERCC1 Asn118Asn（rs11615）正向引物5’-CGGGGACCCTTTAGGAAAG-3’，反向引物5’-GGCTTCTCATAGAACAGTCC-3’；PCR 循環參數：ERCC1 rs11615：94 ℃預變性3 min，94 ℃30 s，62 ℃36 s，72 ℃50 s，共40 個循環，72 ℃延伸5 min，擴增產物4 ℃保存；限制性內切酶消化體系為PCR 產物10 μL，限制性內切酶1 μL，雙蒸水7 μL，緩沖液2μL，總體積20 μL，取含ERCC1 s11615 的PCR 產物10 μL 與限制性核酸內切酶BsrDI 1 μL、雙蒸水7μL、1×反應緩沖液1.8μL、乙酰胺0.2μL，65 ℃消化16 h，4 ℃保存；（3）瓊脂糖凝膠電泳：于燒瓶中加入0.75 g瓊脂糖+25 mL 1×Tris 硼酸電泳緩沖液，微波爐中火加熱至沸騰，倒入已置好梳子的膠膜中，37 ℃放置1 h；待膠凝固后，于電泳前后槽加入1×Tris 硼酸電泳緩沖液及玻璃板，緩慢拔出梳板，調節緩沖液面，即緩沖液面高于膠面，前槽水面略高于后槽，確保緩沖液進入所有加樣孔；吸取酶切產物10 μL，保證吸管垂直加樣孔，緩緩注入DNA 樣品；加樣成功后，設定電壓（120 mV）及時間（25 min），正確接通電泳槽及電源；（4）基因分型：酶切產物經3%瓊脂糖凝膠電泳分型，野生純合子型：兩個堿基突變，無酶切位點，僅有最長片段，電泳圖僅有一條條帶；突變純合子型：兩個堿基無突變，有酶切位點，形成兩條條帶；雜合子型：一個堿基突變，無酶切位點，形成最長片段，另一個堿基無突變，有酶切位點，形成兩個小片段，電泳圖顯示3條條帶。

參照世界衛生組織（WHO）抗腫瘤藥物客觀療效判定標準評估，包含完全緩解、部分緩解、穩定、進展等4 個等級［6］，其中完全緩解與部分緩解屬于治療有效，歸入敏感組，穩定和進展屬于治療無效，歸入耐藥組。

1.3 觀察指標（1）兩組ERCC1 rs11615 多態位點基因型分布。（2）影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析。（3）影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析。（4）隨訪24 個月，不同ERCC1 rs11615 多態位點基因型分布中位無進展生存期（PFS）。

1.4 統計學方法通過SPSS 22.0 處理數據，計數資料以百分數表示，行χ2檢驗；采用logistic 回歸模型分析宮頸癌鉑類化療敏感性的影響因素；采用Kaplan-Meier 法計算中位PFS，比較采用log-rank 分析。P<0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組ERCC1 rs11615 多態位點基因型分布103 例宮頸癌病人經連續化療1～2 周期后，20 例為完全緩解，51例部分緩解，23例穩定，9例進展，總有效率為68.93%（71/103），根據化療效果分為敏感組（n=71）和耐藥組（n=32）。敏感組ERCC1 rs11615位點CT 基因型高于耐藥組，且攜帶ERCC1 rs11615 位點CT基因型的宮頸癌病人化療耐藥的風險低于CC基因型（P<0.05）。見表1。

表1 兩組宮頸癌病人切除修復交叉互補基因1（ERCC1）rs11615位點基因型分布/例（%）

2.2 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析臨床分期Ⅳ期、ERCC1rs11615 位點CC 基因型、有淋巴結轉移、深間質浸潤、低分化程度與宮頸癌鉑類化療敏感性密切相關（P<0.05）。見表2。

表2 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的單因素分析/例（%）

2.3 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析以宮頸癌鉑類化療敏感性為因變量，以臨床分期Ⅳ期、ERCC1rs11615 位點基因型、淋巴結轉移、間質浸潤、分化程度為自變量，納入logistic 回歸分析模型，結果顯示，臨床分期Ⅳ期、ERCC1 rs11615 位點CC基因型、有淋巴結轉移、深間質浸潤、低分化程度是影響宮頸癌鉑類化療敏感性危險因素（P<0.05）。見表3，4。

表3 宮頸癌鉑類化療敏感性影響因素賦值

2.4 不同ERCC1 rs11615 位點基因分布中位PFS隨訪24 個月，ERCC1 基因rs11615 位點CC 基因型病人中位PFS 為9.8 個月，CT 基因型病人中位PFS為10.9個月，log-rank分析差異無統計學意義（P=0.76）。見圖1。

圖1 不同切除修復交叉互補基因1（ERCC1）基因分布中位無進展生存期（PFS）

表4 影響宮頸癌鉑類化療敏感性的多因素分析

3 討論

在中國，宮頸癌每年新發病例14 萬，約占全球宮頸癌新發病例28.8%，且呈年輕化趨勢進展，因此治療方面已由經典手術、放療演變為以放化療、手術為主的綜合治療［7-9］。新輔助化療已被證實是行之有效手段，其中鉑類藥物為廣譜抗癌藥物，可通過形成DNA 加合物，抑制腫瘤細胞RNA 及蛋白質合成，誘導腫瘤細胞凋亡，減少宮旁浸潤，增加手術徹底性機會，然而鉑類化療會引起DNA 損傷，產生化療耐藥［10-11］。

目前臨床認為，機體對鉑類藥物耐受與DNA 損傷修復、藥物失活、藥物蓄積等多種因素有關，DNA損傷修復可能是其中最重要因素［12-13］。亦有學者指出，DNA 修復基因過表達可改變DNA 修復能力，導致腫瘤發生及化療藥物耐藥［14］。ERCC1 基因是DNA 損傷識別及修復重要組成部分，其單核苷酸多態性可能對宮頸癌病人鉑類耐藥及預后產生影響，雖然當前已有ERCC1 基因rs11615 位點C/T 多態性與宮頸癌病人鉑類超敏反應相關研究，但研究結果尚不統一，張龍等［15］認為，ERCC1 基因rs11615 位點TT基因型能增加患宮頸癌患病風險，而CC、CT基因型與宮頸癌發生無明顯關系。有研究指出，RCC1基因rs11615位點C/T基因型化療敏感率高于C/C基因型，且攜帶C/T基因型化療敏感性比C/C基因型增加4.48 倍［16］。分析兩者產生差異原因可能與遺傳背景、地區不同有關。本研究顯示，敏感組ERCC1 rs11615 位點CT 基因型高于耐藥組，且攜帶ERCC1 rs11615位點CT 基因型的宮頸癌病人化療耐藥的風險低于CC 基因型（P<0.05），故推測ERCC1 基因可能作為評估宮頸癌病人鉑類超敏反應指標，為宮頸癌新輔助化療提供新思路。同時本研究中并未發現ERCC1 rs11615 位點TT 基因型，考慮為樣本量偏少所致，仍需在擴大樣本量基礎上繼續研究。

本研究還發現，臨床分期Ⅳ期、ERCC1 rs11615 CC基因型、有淋巴結轉移、深間質浸潤、低分化程度是影響宮頸癌鉑類化療敏感性危險因素（P<0.05）。既往研究指出，淋巴結轉移是影響乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤預后重要因素，淋巴結轉移數目越多，預后相對愈差，轉移數目越少，預后相對愈好［17］。分化程度越低，提示淋巴結轉移發生率越高，病情越嚴重，治療效果越差，越容易產生耐藥。而臨床分期越低提示病情尚處于較早階段，接受以鉑類為基礎的聯合化療方案治療后效果更加明顯，預后越好。同時ERCC1 rs11615 CC 基因型是影響宮頸癌鉑類化療敏感性的又一危險因素，亦從側面說明鑒別診斷ERCC1 基因型分布是臨床評估宮頸癌鉑類化療敏感性的重要指標。此外，梁軍等［18］研究發現，ERCC1及XRCC1基因多態性與中國晚期大腸癌病人接受奧沙利鉑一線化療后生存期有關。有學者指出，晚期非小細胞肺癌病人ERCC1基因型與中位PFS 無顯著相關性［19-20］。在此基礎上，本研究比較宮頸癌病人不同ERCC1 rs11615 位點基因分布中位PFS，結果發現，ERCC1 rs11615 多態位點CC、CT基因型的中位PFS比較，差異無統計學意義，與上述研究結果存在一定差異，分析原因可能與腫瘤類型、ERCC1 基因位點及隨訪時間有關。同時受研究性質局限，鉑類藥物出現耐藥后處理方案并不統一，且病例數較少，無法進行系統評估，尚需嚴格長期隨訪，以便更好了解鉑類藥物超敏反應對宮頸癌病人預后的影響。

綜上，宮頸癌病人鉑類超敏反應與ERCC1 rs11615基因型、臨床分期、淋巴結轉移、分化程度等因素有關，建議臨床重點觀察上述指標，為宮頸癌鉑類化療超敏反應鑒別診斷提供指導依據。