下調微小RNA-425-5p靶向第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白調控宮頸癌細胞侵襲和遷移的分子機制

李敏，趙妍麗，杜國波

作者單位：川北醫學院附屬醫院腫瘤科，四川 南充637000

宮頸癌作為一種常見的惡性腫瘤，其分子發生機制十分復雜，宮頸癌發生與腫瘤組織中異常表達的基因有關［1］。研究報道表明，腫瘤中異常表達的基因可以通過影響腫瘤細胞生長、轉移等生物學行為參與腫瘤進展，靶向基因治療腫瘤是目前研究的重點［2］。微小RNA（miRNA/miR）是由19～24 個核苷酸組成的小分子RNA，miRNA 的產生需要經過細胞核內、細胞質等加工程序，并且每個miRNA 可能有成千上百個作用位點，在不同組織的不同生理進程中參與調控下游蛋白表達［3］。miRNA在物種間的表達具有時序性、保守型性以及組織特異性，參與細胞生長、病變等過程［4］。miRNA 與腫瘤的發生和轉移有關，其參與調控腫瘤細胞惡性表型轉化［5］。研究報道顯示，miR-425-5p 在腎癌、胃癌等組織和細胞中表達上調，下調其表達可以抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移［6-7］。目前已知miR-425-5p 在宮頸癌中表達上調，其高表達與宮頸癌病人腫瘤高分期以及淋巴結轉移呈正相關，并且高表達miR-425-5p 的病人生存率較低，下調miR-425-5p 表達可以誘導宮頸癌細胞凋亡［8-9］。現階段對于下調miR-425-5p 對宮頸癌細胞侵襲和遷移的影響還不明確。

2018 年12 月至2019 年11 月，本研究以宮頸癌Caski細胞為研究對象，通過轉染miR-425-5p抑制劑（inhibitor）下調miR-425-5p 表達水平，探討下調miR-425-5p對宮頸癌細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）抗體、神經鈣黏素（N-cadherin）抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；宮頸癌Caski 細胞購自上海滬震生物科技有限公司；上皮鈣黏素（Ecadherin）抗體購自美國Proteintech Group；miR-425-5p inhibitor 和抑制劑對照（inhibitor control）由杭州泰禾生物技術有限公司構建合成；Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen；siRNA control、PTEN siR?NA購自吉滿生物科技（上海）有限公司。

1.2 細胞轉染宮頸癌Caski細胞中分別轉染miR-425-5p inhibitor 和inhibitor control，轉染具體步驟參照Lipofectamine 2000 轉染試劑具體操作說明書。設置沒轉染的Caski 細胞為Control 組，依次把轉染miR-425-5p inhibitor、inhibitor control 以后的宮頸癌Caski細胞設置為Anti-miR-425-5p和Anti-NC組。

1.3 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）測定miR-425-5p inhibitor 對細胞中miR-425-5p 表達影響收集轉染24 h 以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 組細胞，添加Trizol 試劑，分別將各組細胞中的總RNA 提取并保存在?20 ℃。RNA 濃度測定用紫外分光光度計檢測。取1 μg 的RNA，分別添加以下試劑，配制逆轉錄體系，添加試劑包括：1μL 的逆轉錄酶、1μL 的5×Buffer、1μL 的2.5 U/μL的多腺苷酸聚合酶，添加雙蒸水至25μL，瞬時離心，按照37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min 的逆轉錄程序合成互補DNA（cDNA）。以cDNA 為模板，進行qRT-PCR 檢測，配制反應體系如下：2μL 的miRNA qPCR Primer、10 μL 的2×All-in-one qPCR Mix、2 μL 的Vniversal Adaptor PCR、2 μL 的cDNA，添加雙蒸水至20 μL，PCR 反應程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，15 s。按照公式2?ΔΔCt計算miR-425-5p相對表達水平。

引物序列：miR-425-5p 正向5’-GGGGAGTTAG?GATTAGGTC-3’，反向5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

1.4 MTT 法測定miR-425-5p inhibitor 對細胞增殖影響按照Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 組分組方法將宮頸癌Caski 細胞分別種植在96 孔板內，每孔中吸取100μL 細胞培養液（約含有5 000個細胞），放在37 ℃，飽和濕度，5%二氧化碳培養箱中培養24 h。取出培養板，用移液槍分別在每個孔內添加15μL 的MTT，將培養板繼續放置在37 ℃環境下孵育4 h。吸棄上清溶液，添加二甲基亞砜（Di?methyl sulphoxide，DMSO）各150 μL，觀察結晶物完全溶解以后，調整酶標儀波長為470 nm，檢測每個孔的吸光度，以此表示細胞增殖能力。

1.5 Transwell 小室方法分別檢測miR-425-5p in?hibitor 對侵襲和遷移能力的影響Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p組細胞分別懸浮在無血清的培養液中（細胞密度為2×103個/毫升），吸取200μL 分別添加到Transwell 小室的上室中，加含血清細胞培養液500μL到下室，24 h后，擦掉多余的細胞，固定（4%多聚甲醛），染色（0.1%結晶紫）。分別計數各組細胞遷移數目。侵襲實驗前需用基質膠將小室濕化。

1.6 蛋白質印跡法（Western blotting）分別測定Ncadherin、E-cadherin 蛋白表達Control、Anti-NC、Anti-miR-425-5p 組細胞培養24 h 以后常規方法提取細胞中的總蛋白。蛋白濃度定量用BCA 法，步驟完全按照試劑盒說明進行。灌制10%分離膠和5%的濃縮膠，在電泳槽中添加電泳緩沖液，每孔50μg樣品，80 V 電泳30 min，120 V 電泳1.5 h。根據目的蛋白的數量和大小，將硝酸纖維素膜（NC 膜）裁剪，浸泡至甲醇中。轉膜電流為200 mA，轉膜裝置放在冰上進行，轉膜持續50 min。NC 膜放在新配置的5%脫脂奶粉中孵育2 h；NC膜與一抗、二抗孵育，用化學發光試劑ECL 顯色。N-cadherin、E-cadherin一抗以1∶800 稀釋，二抗以1∶2 000 稀釋。利用Im?age J 分析各組目的和內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）灰度值，比較目的蛋白的表達差異。

1.7 靶基因預測以及鑒定Targetscan 生物信息學軟件預測miR-425-5p 靶基因，結果發現PTEN 和miR-425-5p 可能互為靶向關系。把突變型載體MUT［PTEN 3′非翻譯區（UTR）端互補序列突變］、野生型載體WT（PTEN 3′UTR 端互補序列無突變），分別與miR-425-5p inhibitor、inhibitor control 共轉染至宮頸癌Caski 細胞內，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測24 h 各組細胞中熒光素酶活性的變化。MUT 和WT 分別由南京科佰生物科技有限公司構建。

1.8 PTEN siRNA 影響下調miR-425-5p 的細胞增殖、侵襲和遷移檢測用Lipofectamine 2000 分別將siRNA control、miR-425-5p inhibitor 和PTEN siRNA、miR-425-5p inhibitor 共轉染到宮頸癌Caski 細胞中，分別命名為Anti-miR-425-5p+si-NC 和Anti-miR-425-5p+si-PTEN 組。MTT 法測定細胞增殖，Tran?swell 小室測定細胞侵襲和遷移，蛋白質印跡法測定N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白表達，步驟同上。

1.9 統計學方法利用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料滿足正態分布，按照±s表示，兩組之間的比較采用成組t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析+LSD 法，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-425-5p inhibitor 對宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響在宮頸癌細胞中轉染miR-425-5p inhibitor，細胞中miR-425-5p 表達水平下降，吸光度降低，侵襲數目以及遷移數目減少，N-cad?herin 蛋白表達減少，E-cadherin 蛋白表達增多（均P<0.05）。miR-425-5p inhibitor降低宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間充質轉化（EMT）水平。見圖1，2；表1。

表1 miR-425-5p inhibitor轉染前后宮頸癌細胞中miR-425-5p水平、吸光度、侵襲數目、遷移數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白水平比較/± s

表1 miR-425-5p inhibitor轉染前后宮頸癌細胞中miR-425-5p水平、吸光度、侵襲數目、遷移數目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白水平比較/± s

注：N-cadherin為神經鈣黏素，E-cadherin為上皮鈣黏素。①與Anti-NC組比，P<0.05。

組別Control Anti-NC Anti-miR-425-5p F值P值E-cadherin 0.28±0.03 0.29±0.05 0.65±0.07①144.47<0.001重復次數999 miR-425-5p 1.00±0.09 0.96±0.15 0.32±0.04①122.10<0.001吸光度0.45±0.06 0.47±0.05 0.23±0.04①62.18<0.001侵襲數目96.25±9.51 95.32±7.86 63.17±5.22①53.38<0.001遷移數目138.47±12.14 140.88±13.94 89.64±9.57①52.09<0.001 N-cadherin 0.60±0.05 0.59±0.04 0.30±0.04①137.48<0.001

圖2 蛋白質印跡法檢測各組宮頸癌細胞N-cadherin、E-cadherin蛋白表達

2.2 miR-425-5p 和PTEN 靶向關系預測和鑒定生物信息學軟件發現miR-425-5p 和PTEN 有互補結合位點，WT 和miR-425-5p inhibitor 共轉染后的宮頸癌細胞熒光素酶活性升高（P<0.05），見表2。miR-425-5p和PTEN互為靶向關系。

表2 兩組突變型載體MUT、野生型載體WT熒光素酶活性比較/± s

表2 兩組突變型載體MUT、野生型載體WT熒光素酶活性比較/± s

組別Anti-NC Anti-miR-425-5p t值P值重復次數99 MUT 1.00±0.11 0.97±0.09 0.63 0.540 WT 1.00±0.13 2.68±0.23 19.08<0.001

2.3 下調miR-425-5p 對宮頸癌細胞中PTEN 蛋白表達影響Control 組、Anti-NC 組、Anti-miR-425-5p組宮頸癌細胞中PTEN 蛋白水平分別為（0.46±0.05）、（0.45±0.03）、（0.92±0.08），三組比較差異有統計學意義（F=198.61，P<0.001），宮頸癌細胞轉染miR-425-5p inhibitor 以后，細胞中PTEN 蛋白表達水平升高（P<0.05），見圖3。下調miR-425-5p 促進宮頸癌細胞中PTEN蛋白表達。

圖3 蛋白質印跡法檢測各組宮頸癌細胞PTEN蛋白表達

2.4 PTEN siRNA 對下調miR-425-5p 的宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力影響與共轉染siRNA control、miR-425-5p inhibitor 比較，共轉染PTEN siR?NA、miR-425-5p inhibitor后的宮頸癌細胞吸光度、侵襲數目、遷移數目均升高，PTEN 蛋白水平降低，Ncadherin 蛋白水平則升高，E-cadherin 蛋白表達水平下降（P<0.05），見圖4，表3。

表3 PTEN siRNA轉染前后的下調miR-425-5p宮頸癌細胞吸光度、侵襲數目、遷移數目以及N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白水平比較/± s

表3 PTEN siRNA轉染前后的下調miR-425-5p宮頸癌細胞吸光度、侵襲數目、遷移數目以及N-cadherin、E-cadherin、PTEN蛋白水平比較/± s

注：PTEN為第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白，N-cadherin為神經鈣黏素，E-cadherin為上皮鈣黏素。

組別Anti-miR-425-5p+si-NC Anti-miR-425-5p+si-PTEN t值P值PTEN 0.89±0.10 0.44±0.04 12.53<0.001重復次數99吸光度0.22±0.03 0.39±0.04 10.20<0.001侵襲數目68.31±7.83 88.73±5.24 6.50<0.001遷移數目92.37±6.97 128.43±10.76 8.44<0.001 N-cadherin 0.32±0.03 0.63±0.06 13.86<0.001 E-cadherin 0.60±0.05 0.41±0.04 8.90<0.001

圖4 蛋白質印跡法檢測各組宮頸癌細胞PTEN、N-cadherin、E-cad?herin蛋白表達

3 討論

miRNA 是由其初始產物在細胞核內經過RNA聚合酶Ⅱ特異性作用而形成的［10］。miRNA 生物學功能較多，在不同的組織中表達水平不同，miRNA可能參與決定細胞以及組織的功能特異性［11］。miRNA 與腫瘤的關系十分密切，其在腫瘤進展中發揮類似癌基因或抑癌基因的作用，改變其表達可能是腫瘤治療的途徑［12］。miR-425-5p 在人體中作用廣泛，與脂肪細胞分化、心肌纖維化等有關，miR-425-5p 通過調控細胞的增殖、分化等過程參與疾病進展［13-14］。miR-425-5p 在腎癌細胞和組織中高表達，miR-425-5p 在腎癌細胞惡性生長中發揮促進作用［6］。在胃癌等腫瘤中發現miR-425-5p能夠正調控腫瘤細胞的侵襲和遷移，下調其表達能夠降低腫瘤細胞的轉移潛能［7］。既往的研究顯示，miR-425-5p在宮頸癌中高表達與病人的淋巴結轉移有關，下調miR-425-5p 誘導宮頸癌細胞凋亡［8-9］。本次研究顯示，下調miR-425-5p 后的宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移能力均下降，提示下調miR-425-5p 抑制宮頸癌細胞轉移潛能，這與以前的研究結果相符合，提示miR-425-5p在腫瘤轉移中可能發揮促進作用。

N-cadherin 是間質細胞標志蛋白，E-cadherin 是上皮細胞標志蛋白，其表達水平的改變與細胞EMT水平有關［15］。另外，N-cadherin 是一個在腫瘤中高表達的癌基因，而E-cadherin 是在腫瘤中低表達的抑癌基因，二者表達改變與腫瘤的進展有關［16］。我們的實驗結果表明，下調miR-425-5p 后的宮頸癌細胞中N-cadherin 蛋白表達水平下降，E-cadherin 蛋白表達水平升高，提示下調miR-425-5p 抑制宮頸癌細胞EMT。研究顯示，腫瘤細胞EMT 發生在腫瘤轉移之前，其EMT水平越高細胞轉移能力也就越強［17-18］。本實驗結果充分證實，下調miR-425-5p 可以降低宮頸癌細胞轉移潛能。

研究報道顯示，miRNA 的作用靶點有多個，其與蛋白質的調控因子不同，miRNA 能夠在高層次影響細胞生物學行為，miRNA 在不同的生理或病理進程中調控的靶基因可能不同，這也是miRNA 功能多樣的重要原因［19-20］。在乳腺癌中的研究顯示，miR-425-5p 可以通過靶向調控PTEN 影響腫瘤進展［21］。我們的實驗表明，miR-425-5p 能夠負調控宮頸癌細胞中PTEN 蛋白表達，提示miR-425-5p 參與宮頸癌進展可能也與PTEN 有關。PTEN 是一個與細胞生長有關的抑癌基因，其在宮頸癌中表達下調，上調可以顯著抑制腫瘤細胞的轉移潛能［22］。本研究表明，降低PTEN 表達可以部分逆轉抑制miR-425-5p抗宮頸癌細胞增殖和侵襲、遷移以及EMT 功能，下調miR-425-5p 影響宮頸癌細胞轉移潛能作用機制與靶向調控PTEN 有關，這與上述研究結果相符合，說明下調miR-425-5p 對腫瘤影響的作用機制與PTEN有關。

總之，下調miR-425-5p 具有抑制宮頸癌細胞侵襲和遷移的作用，機制與PTEN 有關，miR-425-5p 可能促進宮頸癌轉移。宮頸癌的分子發生機制較為復雜，今后會在多株宮頸癌細胞以及體內驗證miR-425-5p的作用及下游調控機制。（本文圖1見封三）