中藥材中多環(huán)芳烴的殘留量測定及風險評估

王亞瓊，鐘水生，張華鋒，周堅，薛滿

作者單位：蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州215104

多環(huán)芳烴是有機物不完全燃燒時產生的分子中含有2 個或2 個以上苯環(huán)稠合而成的揮發(fā)性碳氫化合物。早在20世紀，多環(huán)芳烴的致癌作用就被研究者們關注，15種多環(huán)芳烴在1976年被國際癌癥研究中心列為化學致癌物，脂溶性的致癌物對中藥水煎劑的風險較低，但對注射液的影響極大［1-2］。多環(huán)芳烴是具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變作用的重要環(huán)境和食品污染物。多年來，大氣、土壤、水體中多環(huán)芳烴的濃度受到廣泛關注。我國食品安全國家標準GB 2762—2017《食品中污染物的限量》中規(guī)定有食品中苯并（a）芘的限量。歐盟在2015年10月27 日修改了多環(huán)芳香烴在部分產品中的最高限量，其中涉及干的草藥苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽總和的限量。而國內目前尚無中藥來源樣品中多環(huán)芳烴的限量要求。

多環(huán)芳烴的分析方法包括液相色譜法［3］、液質聯(lián)用法［4］、氣相色譜法［5］、氣質聯(lián)用法［6］等，多見于環(huán)境和食品專業(yè)的報道［7-17］。近年來，中藥材中多環(huán)芳烴污染也逐漸受到中藥安全性研究者們的關注，天花粉、大黃、葛根等藥材中均檢出多環(huán)芳烴的殘留［6，18］。本研究以平時抽檢工作中收集的多來源中藥樣品為研究對象，采用環(huán)境污染監(jiān)測國際通用的16 種多環(huán)芳烴為指標，氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GCMS/MS）測定中藥材中多環(huán)芳烴的殘留，為今后中藥中多環(huán)芳烴殘留量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料超細勻漿機AS145S-P（上海昂尼儀器儀表有限公司，China），高速打粉機（Asone，Japan），電子天平AG245（METTLER，Swiss），超聲儀（HU615 OF，China）。氣相質譜（GC-MS）系統(tǒng)（GC：Agi?lent6890N 氣相色譜儀，配Agilent7683B 自動進樣器；MS：Agilent7000c，USA）。氣相毛細管柱（DB-5MS，0.25μm，30 m×0.25 mm，J&W Scientific，USA）。16 種多環(huán)芳烴混合標準品（2 000 ng/μL in Acetone/Benzene，Germany），4 種氘代同位素內標（CDN ISO?TOPES，Canada）（表1），乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷（HPLC，Honeywell 農殘級別，USA）。SPE 小柱（200 mg/3 mL，Agilent，USA），QuEChERS SPE（SHIMAD?ZU-GL，Japan）。實驗樣品：根類藥材34 份、木類藥材8 份、果實種子類藥材8 份、花類藥材31 份（其中金銀花25份）、皮類藥材6份、菌類藥材4份、動物類藥材4 份、寄生類藥材4 份、葉類藥材3 份及全草類藥材7 份，共計109 份樣品來自日常檢驗工作中的對照藥材、抽檢及送檢。所有樣品照現(xiàn)行標準檢驗結果均符合規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1色譜及質譜條件 氣相升溫程序：初始溫度75 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至150 ℃，再以3 ℃/min 升溫至300 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升溫至320 ℃，保持1 min。載氣為高純氦，流速1.5 mL/min。進樣口溫度：310 ℃，不分流脈沖進樣。離子源為EI，電子能量：70 eV。四級桿溫度：180 ℃，離子源溫度：310 ℃。16 種及4 種氘代同位素內標多環(huán)芳烴質譜多反應監(jiān)測技術（MRM）模式具體選擇離子見表1。

表1 16種及4種氘代同位素內標多環(huán)芳烴質譜多反應監(jiān)測技術（MRM）模式具體選擇離子

1.2.2 樣品提取 精密稱取藥材細粉2 g，加含4 種同位素內標（10 μg/L）乙腈溶液10 mL，靜置24 h 后超聲提取10 min，過濾，即得。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將測定數(shù)據(jù)導入Agilent Mass?Hunter Quantitative Analysis 進行定量分析，采用基質標曲內標法計算。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 標準曲線、定量限、檢出限及基質效應 用乙腈將16 種多環(huán)芳烴標準溶液稀釋成一定濃度的貯備液，逐步稀釋，進樣，S/N=3 時為檢測限，S/N=10時為定量限，根據(jù)定量限的結果我們加入內標溶液逐級稀釋成多環(huán)芳烴質量濃度分別為1、2、5、10、25、50、100、150、200 μg/L 的系列混合標準溶液，內標質量濃度均為20 μg/L。以待測物相對濃度為橫坐標（x），待測物與對應內標物峰面積相對響應為縱坐標（y），用Agilent MassHunter Quantitative Analysis進行分析，可得內標法標準曲線線性回歸方程，同時用空白基質樣品（目標物低于檢出限）配制標準曲線，制備有基質的系列標準曲線樣品，進行分析。標準曲線、檢測限、定量限及相關系數(shù)R2具體結果見表2。由空白標準曲線與基質標準曲線的斜率比較得知目標化合物的基質效應較低，基本對測定無影響，滿足痕量測定要求。

表2 16種多環(huán)芳烴分析用內標物及標準曲線

1.2.4.2 重復性、穩(wěn)定性 重復性樣本取金銀花樣品6份，按“1.2.2”方法分別提取后進樣，計算目標物相對標準差（RSD）。穩(wěn)定性樣本提取后室溫放置0、2、4、8、16、32、48 h 進樣，計算目標物在所有時間段的總RSD。結果見表3。結果可見目標測定物的重復性及穩(wěn)定性均較好。

表3 16種多環(huán)芳烴的重復性、穩(wěn)定性/%

1.2.4.3 精密度 取標準曲線高、中、低（150μg/L，40μg/L，2μg/L）3個濃度點樣品分別進樣6次，計算RSD。結果見表4。

表4 16種多環(huán)芳烴的精密度/%

1.2.4.4 回收率 參考國內外多數(shù)法定標準采用苯并（a）芘不得超過5 μg/kg 的限量標準，進行3 水平添加實驗［6］。取空白基質樣品分別添加高濃度25μg/kg、中濃度5μg/kg、低濃度1μg/kg的混合標準溶液，每個濃度水平平行測定3 份，計算回收率及RSD，結果見表5。

表5 16種多環(huán)芳烴的回收率/%

2 結果

本次實驗分析方法學滿足痕量分析要求，個別多環(huán)芳烴單體基質效應影響較大，因此所有樣品采用基質標曲計算濃度。109 份樣品均檢出多環(huán)芳烴污染物，多環(huán)芳烴單體濃度范圍為未檢出至548.3μg/kg，16 種多環(huán)芳烴之和的濃度范圍為27.5～2 409.4 μg/kg。2-4 環(huán)的多環(huán)芳烴檢出率較高，5 環(huán)及以上的檢出率較低。樣品中以小分子多環(huán)芳烴為主。從各類樣品平均檢出總濃度看，花類>葉類>動物類>果實種子類>皮類>根類>菌類>全草類>木類>寄生藤類。花類樣品對多環(huán)芳烴富集濃度最高，葉類、動物類、根類等次之。

3 討論

（1）毒性當量因子評價：國際上對苯并（a）芘的研究最早，且具有很強的致癌性，常以其作為多環(huán)芳烴污染的標志物，食品安全國家標準GB 2762—2017《食品中污染物的限量》中規(guī)定食品中苯并（a）芘在谷物、肉類和水產動物產品中限量為5 μg/kg。參考該限量指標，利用毒性當量因子［19］計算樣品中16種多環(huán)芳烴總毒性當量濃度（toxic equivalent con?centration，TEC），即相對于苯并（a）芘的濃度，用于進行風險評估。109 份樣品中11.8%的根類、12.5%的果實種子類、9.7%的花類結果超限。

（2）點評估法評價：采用點評估法，以金銀花樣本為例，對多環(huán)芳烴攝入暴露風險進行研究，美國環(huán)境保護署（EPA）點評估模式，急性點評估和慢性點評估的暴露量模型分別按公式（1）和（2）計算。

EXPa=LP×HR/bw…（1），

式（1）中：EXPa 為急性膳食暴露量（acute di?etaryexposure portion），LP 為金銀花日消費最大量97.5 百分位點值（kg/d），根據(jù)《中國藥典》2015 年版金銀花項下日用量為6～15 g 的規(guī)定，取0.015 kg 作為日消費最大量；HR 為金銀花中檢出的多環(huán)芳烴最大值（mg/kg）；bw為平均體質量（kg），以60 kg計。

EXPc=I×R/bw…（2），

式（2）中：EXPc 為慢性膳食暴露量（chronic di?etary exposure portion），I為人參的平均日消費量（kg/d），依據(jù)《中國藥典》取值為0.001 kg；R 為金銀花中多環(huán)芳烴（μg/kg）平均值。每日允許攝入量（accept?able daily intake，ADI）值以5 μg/kg 為參考計算，風險評估采用EXPa 和EXPc 與ADI 值比值評價急性、慢性攝入風險，即急性風險商和慢性風險商。當比值≤1時，認為該危害物產生的風險是可接受的；當≥1 時，認為該危害物產生的風險超過可接受的限度，應采取適當?shù)娘L險管理措施。經計算EXPa=6.4×10-6，EXPc=0.3×10-6，急性風險商為5.1 和慢性風險商為0.34，從結果可看出，金銀花中多環(huán)芳烴的EX?Pc 顯著低于ADI 值，慢性風險商遠低于1，說明慢性風險較小。而急性暴露風險，急性風險商明顯高于1，超過臨界值，急性暴露風險較高，需要進行控制，急需制定相關的標準進行控制。

本研究對10 種類別109 份中藥樣本中16 種多環(huán)芳烴的殘留量進行GC-MS/MS 內標法的含量測定，以25 份金銀花樣本為例，采用點評估法進行風險評估。發(fā)現(xiàn)中藥中多種來源的樣本均存在多環(huán)芳烴的污染，按食品及歐盟的標準，多環(huán)芳烴超標率較高，存在一定的風險。建議盡快制定控制中藥中多環(huán)芳烴殘留量的相關標準，保障中藥的安全使用。