金納米星診療劑的光熱特性及其在光熱治療和光學相干層析成像中的應用研究

吳 哲，陸冬筱 ，李金華

（1.長春理工大學 物理學院 吉林 長春 130022；2.納米光子學與生物光子學吉林省重點實驗室，吉林 長春 130022）

1 引 言

在過去的幾十年間，人們對于癌癥的研究方式有了巨大的轉變。治療和診斷相結合的診療一體化已經成為癌癥診療研究的熱點。實現診療一體化不但可以實時精確地診斷病情，也能夠同時加以治療，從而獲得良好的治療效果[1]。

光熱治療作為一種新興的微創治療癌癥方法，是利用納米粒子吸收光能轉化為熱能，引起腫瘤部位溫度升高，殺死癌細胞的方法[2]，在惡性腫瘤治療中具有潛在的應用價值[3]。以各種材料開發的光熱劑作為引導光熱治療的關鍵媒介也逐漸被研究人員報道[4-6]。如碳基納米材料[7]、硫化銅納米材料[8]和過渡金屬硫化物[9]等。在這些被開發的光熱劑中，金納米粒子因為具有獨特的局域表面等離子共振(LSPR)特性[10]，使其在受激光輻照時對光的吸收性能增強，并能夠將吸收的光能高效轉化為熱能，因此是一種有潛力的光熱劑材料。此外，由于金納米粒子較好的生物兼容性[11]、高穩定性和較為簡單的表面功能化[12-13]的特點，更使其作為一種出色的生物醫療材料而受到關注。研究者們已經設計了許多種金納米結構，如金納米棒[14]、金納米殼[15]、金納米籠[16]和納米球[17]都已被證明在近紅外區具有等離子體共振特性，并可在近紅外激光照射下產生熱量從而殺死癌細胞。

光學相干層析成像(OCT)是一種新興的成像技術，可以在保持較高分辨率的情況下對微米級別的生物組織進行成像[18]。由于OCT技術具有非接觸、無損傷、圖像分辨率高且操作簡單的優點[19]，研究人員不斷開拓OCT在生物成像上的應用[20]。最早期Wang等人利用光學多普勒層析成像技術實現了對血管的無創造影[21]。之后，人們逐步開發了許多有針對性提高OCT成像效果的造影劑作為輔助，比如聚吡咯納米粒子[22]、金、銀等貴金屬納米粒子[23-24]。其中，金納米材料被人們開發出了多種形貌用于研究其造影性能。

為了達到更好的診療效果，實現高效診療一體化，本文將光熱治療與OCT成像相結合，并選用金納米材料作為診療劑。利用金納米材料尖銳尖端的電場增強特性[25-26]，設計制備多尖刺狀結構的金納米星（Au Nano Stars, AuSTs）材料，以提高其表面等離子體共振效應，進而提升基于金納米星診療劑的光熱治療效果和OCT成像效果。研究結果顯示制備的金納米星診療劑具有優異的光熱特性和生物兼容性，其光熱效率達到42%，將制備的金納米星診療劑用于乳腺癌細胞的光熱治療，癌細胞存活率低至37%。同時，制備的金納米星診療劑具有優異的OCT成像造影特性，在癌癥診療一體化領域具有較好的應用前景。

2 實驗部分

2.1 材料和試劑

檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O, 99%, Alfa Aesar)、鹽酸(HCl, 分析純, 北京化工廠)、氯金酸(HAuCl4·4H2O, 99.99%, Alfa Aesar)、硝酸銀(Ag-NO3, 99%, Alfa Aesar)、抗壞血酸(AA, 分析純, 國藥集團上海試劑有限公司)、高糖培養基（DMEM,CORNING）、磷酸鹽緩沖液(PBS, Solarbio)、噻唑藍（MTT, C18H16N5SBr，Alfa Aesar）。

2.2 金納米星診療劑的制備

金納米顆粒（種子液）的制備：首先配制100 mL濃度為1mM的HAuCl4溶液，加熱至沸騰后，向其中加入15mL質量分數為1%的檸檬酸三鈉水溶液。在保持體積穩定的情況下，持續沸騰15 min之后自然冷卻至室溫，得到了AuNPs，將其作為種子液，在4℃保存備用。

金納米星的制備：向10 mL濃度為0.25 mM的HAuCl4溶液中加入20 μL濃度為1 M的HCl 溶液。在中速攪拌的條件下加入100 μL種子液。同時迅速加入100 μL濃度為2 mM的Ag-NO3溶液和50 μL濃度為100 mM的抗壞血酸溶液。1 min后混合溶液從淺紅色變為藍黑色，說明反應完成。立即進行3 000～5 000 r/min離心。然后使用去離子水進行分散。4℃保存備用。

2.3 金納米星診療劑的表征

使用透射電鏡（TECNAI G2 20 S-TWIN,FEI）和X射線衍射分析儀（D8 Advance，布魯克）觀察金納米星的形貌和結構，使用紫外-可見分光光度計（UV-Vis，UV-2450，島津）測定金納米星的吸收光譜，使用粒度分析儀（ZetaSizer，Malvern）測定樣品尺寸，808 nm激光器（長春新產業技術有限公司）用于材料的光熱特性和體外光熱治療研究，酶標儀（M200PRO, Infinite）用于測定細胞存活率時的吸光度，光學相干層析成像儀（Telesto-1 325 nm, ThorImage）用于OCT成像研究。

2.4 金納米星診療劑的光熱特性曲線測試

溫度時間曲線測試：取不同溶液于離心管中，使用808 nm激光器進行照射，記錄溫度-時間變化曲線。

光熱穩定性測試：取一定濃度的AuSTs溶液于離心管中，2 W/cm2的808 nm激光器照射，照射10 min后停止照射，10 min后再繼續照射。反復5個循環，記錄溫度-時間曲線，并比較每個循環的最終溫度。

2.5 金納米星診療劑的生物兼容性測試

細胞和診療劑培養：將人乳腺癌細胞MCF-7接種于96孔板中。用200 μL DMEM培養基孵育24 h后，更換全新的DMEM培養基180 μL，之后向其中分別加入20 μL不同濃度的AuSTs，每個濃度設置6個孔。另有一個空白對照組，向其中加入20 μL PBS緩沖液，與細胞再培養24 h。

使用噻唑藍比色法（MTT）對金納米星診療劑的生物兼容性進行測試：向上面培養好的實驗組和對照組中分別加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL)，繼續共培養4 h。移除培養基和未反應的MTT，向每個孔中加入200 μL DMSO來溶解Formazan晶體。室溫下持續振蕩15 min后使用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度。計算公式如下：細胞活性(%)=實驗組吸光度/對照組吸光度×100%。

2.6 金納米星診療劑對乳腺癌細胞進行光熱治療實驗

細胞和診療劑培養方法同2.5節。

對癌細胞進行光熱治療：將上面培養好的實驗組和對照組更換新鮮的培養基，之后進行光熱治療實驗。使用808 nm，2 W/cm2激光器對實驗組和對照組分別進行照射。記錄時間以保證每個孔徑照射時間為10 min。之后，利用MTT法測定細胞活性：具體方法同2.5節。

2.7 金納米星診療劑對模擬組織進行光學相干層析成像測試

首先，按照文獻報道的方法制備了模擬組織的第二類組織體模[27]。具體制備方法如下：將0.2 g聚乙烯醇（PVA）加入至10 mL煮沸的去離子水中，并向其中加入4 mL AuSTs溶液。在沸騰狀態下持續攪拌30 min后，倒入模具中，進行光學相干層析成像觀測。

隨后，采用鯽魚眼部作為真實生物組織，進行前房注射AuSTs溶液，觀察注射前后的OCT成像變化。

3 結果和討論

3.1 金納米星材料的表征

在制備AuSTs的過程中，為了實現其刺狀結構與尺寸的一致性控制，探究了不同Ag+濃度對AuSTs形貌的影響。對制備的AuSTs進行了表征（圖1）。圖1（a）、1（b）和1（c）分別是Ag+濃度為1 mM、2 mM和4 mM制備所得AuSTs的透射電鏡照片，可以看出隨著Ag+濃度的增加對于AuSTs的尺寸沒有明顯的影響，但隨著Ag+的濃度增加，在Au的球核上長出的尖刺變得更多、更長且更尖。圖1（b）的插圖為枝狀結構的高分辨透射電鏡照片，經測量，其晶格間距約為2.03 ?左右，與Au的(200)晶面對應，說明已經制備出多枝狀的金基納米星材料(AuSTs)。圖1（d）為AuSTs的XRD圖譜，可以看出樣品的衍射峰與標準卡片對應，且衍射峰較強，這說明本文制備的AuSTs材料的結晶性較好。對AuSTs進行了粒徑分析，其直徑在70 nm左右（圖1（e）），這個尺寸適合細胞光熱治療實驗。對制備的AuSTs進行了吸收光譜表征，AuSTs在500～900 nm具有一個較寬的吸收波段（圖1（f）），吸收峰位于780 nm處，在808 nm處也有較強的吸收，這有利于其在基于近紅外光的光熱治療中的應用。

圖1 金納米星的表征。Ag+濃度分別為（a）1 mM，（b）2 mM和（c）4 mM金納米星的透射電子顯微鏡照片。（d）金納米星的XRD圖譜。（e）金納米星的粒徑分析。（f）金納米星的吸收光譜Fig.1 Characterization of AuSTs.Transmission electron micrographs of gold nanostars with Ag+ concentrations of (a) 1 mM,(b) 2 mM and (c) 4 mM.(d) XRD patterns of AuSTs.(e) Particle size of AuSTs.(f) Absorption spectra of AuSTs

3.2 金納米星診療劑的光熱性能研究

本文首先研究了激光器功率對材料光熱性能的影響，如圖2（a）所示。結果顯示，隨著激光器功率密度的增加，AuSTs的光熱性能有了明顯的提高。隨后對不同Ag+濃度所制備AuSTs的光熱性能進行了探究。結果顯示，由于Ag+濃度為2 mM時制備的AuSTs在808 nm處具有最高的吸收強度，所以也具有最好的光熱效果，其溫度極限達到了56.9℃（圖2（b））。腫瘤細胞的敏感溫度為50℃，在這一溫度環境下，腫瘤細胞會大量死亡，所以制備的金納米星診療劑可以用于對腫瘤細胞進行光熱治療。然后，研究AuSTs診療劑濃度對光熱效果的影響，隨著AuSTs濃度的升高，AuSTs溶液的升溫速率和極限溫度也在進一步提高（圖2（c））。在對不同形貌的金納米材料的光熱性能研究的結果顯示，與水相比，金納米材料在激光照射10 min后，具有明顯的光熱效果，而AuSTs的升溫速率和極限溫度要明顯高于AuNPs（圖2（d））。此外，研究了AuSTs診療劑的光熱穩定性，結果如圖2（e）所示，可見，每次光照后樣品均能升高到相近的溫度，升降溫速率也基本保持不變，說明制備的AuSTs診療劑的光熱穩定性較好。依據公式計算了AuSTs的光熱轉換效率，如下：其中，TMax代表激光照射過程中的最高溫度；TSurr代表環境溫度；MD為溶液質量，CD為溶液比熱容；τs代表特征熱時間常數；h為傳熱系數；S為樣品容器表面積；I為激光功率；Aλ為在某處波長的吸光度；QDis為樣品容器和溶劑所吸收的能量。

圖2 金納米星的光熱性能測試。（a）AuSTs在808 nm激光不同功率密度下的溫度-時間曲線。在808 nm，2 W/cm2激光照射下。（b）不同Ag+濃度制備的AuSTs的溫度-時間曲線。（c）不同濃度金納米星的溫度-時間曲線。（d）AuSTs、AuNPs和去離子水的溫度-時間曲線。（e）金納米星系統的光熱穩定性測試。（f）金納米星系統的特征熱時間常數Fig.2 Photothermal property of AuSTs.(a) Temperature-time curves of AuSTs at different power densities.Under 808 nm,2 W/cm2 laser irradiation.(b) Time-temperature curve of AuSTs prepared with different Ag+ concentrations.(c) Temperature-time curves of AuSTs at different concentrations.(d) Temperature-time curves of AuSTs, AuNPs and DI Water.(e) Photothermal stability of AuSTs.(f) Graph of cooling period of the time versus negative natural logarithm of the temperature

具體計算過程如下：選取圖2（c）中降溫過程，根據公式(1)和溫度T計算出θ，然后以-lnθ為橫坐標，時間為縱坐標作圖（圖2（f）），擬合直線的斜率即為系統熱時間常數τs。隨后帶入公式(2)中計算出hS，最后根據公式(3)計算出AuSTs的光熱轉換效率η=42%，而實驗組中的金納米顆粒光熱轉換效率為36%。

金納米星的光熱效率高于金納米顆粒是因為金納米星比金納米顆粒具有更多尖銳的尖端結構和更大的金核，而金納米材料的中心核的尺寸、尖刺的長徑比、尖刺的長度和數量越多，其具有的LSPR效應越強[10]。而金納米材料的光熱轉換過程主要依賴LSPR效應，因此金納米星的光熱轉換效率要遠高于金納米顆粒。同時，金納米星的多尖端結構使其在近紅外區存在較大的吸收截面，使入射的近紅外光能夠高效被吸收，以用于光熱轉換[28]。

3.3 金納米星診療劑的光熱治療效果研究

對AuSTs診療劑的生物安全性進行研究，使用MCF-7乳腺癌細胞通過噻唑藍比色法(MTT)進行了生物兼容性測試，結果如圖3（彩圖見期刊電子版）所示，不同濃度下，細胞的存活率均可達到80%以上，隨著診療劑濃度的增加，細胞存活率下降非常緩慢，說明制備的AuSTs診療劑具有較好的生物安全性。

圖3 金納米星診療劑的生物兼容性測試Fig.3 Biocompatibility test of AuSTs

隨后研究了不同濃度的AuSTs診療劑對MCF-7乳腺癌細胞的光熱治療效果。如圖4（彩圖見期刊電子版）所示，選擇808 nm，2.0 W/cm2的激光對癌細胞進行照射，在不使用AuSTs診療劑或不經激光照射時，對癌細胞的殺傷作用不明顯。而在使用AuSTs診療劑并經激光照射后，對癌細胞的殺傷效果顯著提高。隨著AuSTs診療劑濃度的增加，癌細胞的存活率接近直線下降。使用濃度為100 μg/mL的AuSTs診療劑對癌細胞進行光熱治療后，癌細胞存活率大幅降低為37%，說明制備的AuSTs診療劑具有優異的乳腺癌細胞光熱治療效果。

圖4 金納米星診療劑的光熱治療效果Fig.4 The photothermal therapy effect of AuSTs

3.4 金納米星診療劑的OCT成像造影效果研究

使用聚乙烯醇(PVA)制作了模擬第二類組織體模[27]用于OCT成像研究，結果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。從圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)中可以看出，添加去離子水前后的組織體模的OCT圖像沒有明顯差異，而添加了30%聚乙二醇（PEG）作為造影劑的組織體模的信號強度也沒有明顯提高，這說明去離子水沒有造影效果，而PEG作為一種常用的造影劑在30%濃度下的造影效果也不如AuSTs理想。在使用AuSTs診療劑后，組織體模的OCT成像效果顯著提高，而且成像深度也有較大提升，可以達到近2 mm。此外，對于圖5(a)、圖5(b)和圖5(c)中框選區域的信號強度進行了統計可以發現，在深度測量范圍內，使用AuSTs診療劑后樣品的成像信號強度遠高于不使用AuSTs診療劑時樣品信號的強度（圖5(d)）。而且使用AuSTs診療劑后，當深度從0變化到0.8 mm時，樣品的成像信號強度逐漸增強，在0.8 mm處信號最強，說明AuSTs診療劑在0.8 mm深度下的濃度最大，隨著AuSTs診療劑濃度的增加，樣品成像信號也逐漸變強，并且在組織體模的更深處同樣有較強的信號。

圖5 AuSTs作為造影劑在OCT成像中的效果。（a）加入去離子水的組織體模。（b）嵌入PEG-200的體模成像效果。（c）嵌入AuSTs的體模成像效果。（d）對（a)、（b)和（c)中框選區域的信號強度統計。鯽魚眼部AuSTs造影劑注射前（e）和注射后（f）的OCT成像效果。（g）對（e）和（f）中框選區域的信號強度統計Fig.5 OCT imaging with AuSTs as contrast agents.OCT image of simulated tissue with (a) DI water, (b) PEG-200, and(c) AuSTs.(d) OCT signal intensity on depth of simulated tissue with DI water, PEG-200 and AuSTs.The OCT imaging effects of AuSTs in the eyes of crucian carp before (e) and after (f) injection.(g) Statistics on the signal strength of the area selected in (e) and (f)

此外，OCT也被常用于眼科疾病的診斷。本課題組利用鯽魚眼部作為活體模型，來研究AuSTs作為診療劑在體內的應用。為了清晰地進行比較，先對鯽魚眼部進行OCT成像。在圖5(e)中可以清晰地看出眼部的角膜、前房和晶狀體結構。而前房部位由于房水透明導致這一部位的信號強度較弱。在前房注射AuSTs作為造影劑之后，其信號強度有了明顯提高（圖5(f)）。對框選區域進行了信號強度統計，如圖5(g)所示，在相同部位信號強度有了大約10倍的提高。這說明制備的AuSTs診療劑是一種優異的OCT成像造影劑。

4 結 論

這項工作利用尖端結構增強金納米材料的局域表面等離子共振特性，成功設計制備了AuSTs診療劑，使其在近紅外區域具有優異的光熱特性，其光熱轉換效率高達42%。此外，將制備的AuSTs診療劑用于對MCF-7乳腺癌細胞的光熱治療以及對組織體模進行OCT成像的應用研究。由于具有較高的光熱轉換效率，AuSTs診療劑具有較好的腫瘤光熱治療能力，當AuSTs診療劑濃度為100 μg/mL時，對MCF-7乳腺癌細胞進行光熱治療后，癌細胞存活率低至37%。由于具有較高的光散射特性，AuSTs診療劑具有較好的OCT成像造影能力，在使用AuSTs診療劑后，模擬組織樣品的成像深度和信號強度顯著提升,與空白對照組相比，添加AuSTs診療劑的模擬組織成像深度可達2 mm。由此可知，制備的AuSTs診療劑既具有高效的光熱治療能力，又具有出色的OCT成像造影能力，有望在未來多種功能協同作用的診療一體化平臺中進行更廣泛的應用。并且，金納米粒子作為一種易于偶聯修飾的納米材料，其在多功能和高效率的生物醫學領域有著非常好的應用前景。