急性髓系白血病67種基因突變檢查及臨床意義

黃 莉， 林麗娥， 符祥俊， 郭 麗， 孟 燦

(海南省人民醫院/海南醫學院附屬海南醫院血液內科， 海南 海口 570311)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是來源于髓系造血干祖細胞的惡性克隆性血液系統疾病，臨床以正常造血抑制、組織器官浸潤等為主要癥狀[1]。當前，多種強效化療藥物的聯合應用是臨床AML治療的主要手段，但老年AML患者免疫力普遍較低，無法耐受強效化療藥物，在一定程度上影響了治療療效[2]。若能對老年患者進行綜合性的評估，擬定個體化治療方案，將有利于老年患者的預后。研究發現，AML在細胞遺傳學和分子水平上具有高度異質性，而基因突變在AML的發生發展、預后分層中發揮重要作用[3]。當前，有關老年AML基因突變的研究多局限于個別基因，包含多種基因突變的基因突變譜與老年AML患者臨床特征、預后的關系有待進一步研究。本研究分析了AML患者67種基因突變的發生情況及其與患者臨床特征、預后的關系，旨在加強對AML發病機制的理解，為老年AML患者臨床治療方案的制定提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年5月至2019年5月在本院接受治療的AML(非急性早幼粒細胞白血病)患者117例，納入標準：①臨床檢查符合AML的診斷標準[4]，且均經細胞形態學、分子生物學、遺傳學及免疫學檢查確診：外周血或骨髓原始細胞≥20%、存在克隆性重現性細胞遺傳學異常、2個髓系免疫表型陽性且淋系標記<2個或髓過氧化物(MPO，+)或非特異性酯酶(+)或丁酸鹽(+)；②患者性別不限，年齡≥60歲，均為初診確診患者；③均接受化療治療患者；④患者知情同意，均簽署知情同意書。排除標準：①急性早幼粒細胞白血病及其他類型白血病患者；②合并其它惡性腫瘤、血液疾病患者；③接受造血干細胞移植患者；④一般臨床資料不完整，不能定期復查患者。本研究經醫院倫理委員會批準，符合赫爾辛基宣言。

1.2方 法

1.2.1一般臨床資料收集：收集患者的性別、年齡、初診時白細胞計數(whtie blood count，WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)和骨髓原始細胞水平等一般臨床資料。

1.2.2AML分類及染色體核型分析：患者就診后行骨髓穿刺術抽取骨髓血0.2～0.3mL涂片，進行形態學及細胞化學染色檢查；參考法美英(France-America-British，FAB)分類標準將AML患者分為M0～M7型[5]。骨髓細胞經過24h～48h培養后，收集細胞常規制片，采用G顯帶技術進行核型分析，根據患者染色體核型結果進行危險度分層，將AML患者分為低危核型、中危核型和高危核型。

1.2.3基因突變檢測：采用二代測序技術進行基因突變檢測。取患者血液樣本，分離并收集骨髓單個核細胞，采用QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度儀(UV240型，島津實驗器材有限公司)測定基因組DNA濃度和純度，樣品稀釋至50ng/μL備用。取樣品基因組DNA10～17ng，采用Ion Torrent檢測平臺中的Ion Ampliseq超高多重PCR靶向技術，富集112個基因血液系統疾病相關基因的外顯子區、UTR及靠近外顯子的部分內含子區域。測序后數據利用dbSNP，1000genome，polyphen2，cosmic等數據庫進行篩選和突變驗證。

1.2.4治療方案：患者接受DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)方案、IDA(去甲柔紅霉素+阿糖胞苷)方案或以維甲酸、亞砷酸為主的初始誘導化療方案進行化療。誘導治療后達完全緩解患者接受4個療程的鞏固化療(阿糖胞苷)；部分緩解和原始細胞下降大于50%者給予第2次誘導化療，2個療程后再進行療效評價，確定是否進行鞏固化療。

1.2.5隨訪：對基因檢測結果顯示基因突變的患者進行隨訪，隨訪形式包括門診定期隨訪、問卷及電話隨訪。隨訪截止為出院后2年，確診之日至死亡或末次隨訪日期為總體生存(OS)時間。

1.3統計學處理：采用SPSS20.0統計軟件對數據進行分析。非正態分布的計量資料以中位數(P25～P75)表示，行Mann-Whitney非參數檢驗；計數資料以n(%)表示，行Fisher確切概率檢驗，兩兩比較采用矯正檢驗水準的Bonferroni法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較采用log-rank檢驗；預后影響因素分析采用Cox比例風險回歸分析；檢驗水準：α=0.05。

2 結 果

2.1AML患者一般臨床資料分析：117例患者中，男61例，女56例；中位年齡69(60～79)歲；初診時WBC中位數12.83(2.36～53.48)×109L-1，HGB中位數78.46(61.47～98.71)g/L，骨髓原始細胞中位數65.47(10.53～80.24)%；FAB分型及危險度分層見圖1。

圖1 117例AML患者FAB分型及危險度分層(A)FAB分型；(B)危險度分層

2.2AML患者基因突變發生情況分析：117例患者中，108例(92.31%)患者檢查基因突變，其中單基因突變25例(21.37%)，2個基因突變共存36例(30.77%)，同時攜帶≥3個基因突變的47例(40.17%)。檢測到的基因突變共涉及67種基因，108例患者中突變檢出率≥10%的突變基因依次為NRAS突變25例(23.15%)，NPM1突變21例(19.44%)，DNMT3A突變17例(15.74%)，TET2突變16例(14.81%)，WT1突變13例(12.03%)，CEBPA突變13例(12.03%)，FLT3-ITD+TKD突變12例(11.11%)，GATA2突變12例(11.11%)，ASXL1突變11例(10.19%)，BCORL1突變11例(10.19%)。其他突變檢出率不足10%但大于5%的突變基因包括：IDH1、IDH2、JAK2、PTPN11、RUNX1、SETBF1、SRSF2突變9例(8.33%)，KIT、ETNK1、NF1、KRAS、SRP72、STAG2、TP53突變6例(5.56%)。突變檢出率不足5%的突變基因包括：ABL1、AKNRD26、ATM、BCOR、BRAF、CALF、CBL、CSF3R、CSMD1、CUX1、DDX41、EP300、ETV6/TEL、EZH2、GATA1、GNAS、IKZF1、JAK1、JAK3、NFE2、KMT2C/MLL3、KMT2D/MLL2/MLL4、MPL、LNK(SH2B3)、PDGFRA、NOTCH1、PHF6、PIGA、PRPF40B、PRPF8、PTEN、RAD21、ROBO1、ROBO2、SF1、SF3A1、SF3B1、SMC1A、SMC3、SUZ12、TET2、U2AF1/U2AF35、U2AF2、ZRSR2。

2.3AML患者基因突變的功能類型分布：將突變檢出率≥5%的突變基因按照功能進行聚類分析，常見突變基因涉及的通路包括：表觀遺傳學(占57.41%，包括：DNMT3A、TET2、ASXL1、IDH1、IDH2)，信號通路(占50.93%，包括：NRAS、JAK2、PTPN11、KIT、KRAS)，轉錄調節(占49.07%，包括：WT1、CEBPA、GATA2、RUNX1、STAG2)，細胞增殖或凋亡(占25.00%，包括：NPM1、TP53)，剪切因子(占8.33%，包括：SRSF2)，其他(占35.19%)。

2.4部分基因突變與AML患者臨床特征之間的關系：NRAS基因突變患者HGB水平低于無突變患者(P<0.05)，NPM1基因突變WBC水平高于無突變患者(P<0.05)；DNMT3A基因突變患者WBC、HGB和髓原始細胞水平與無突變患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 部分基因突變與AML患者臨床特征之間的關系[M(P25～P75)]

2.5部分基因突變與AML患者染色體核型危險度分層之間的關系：NPM1、DNMT3A基因突變在中危患者中的檢出率高于低、高危患者(P<0.05)，NRAS基因突變在低危、中危和高危患者中的檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同染色體核型危險度分層患者的部分基因突變檢出情況n(%)

2.6基因突變AML患者預后情況分析：108例AML患者的中位OS為8個月，兩年累計生存率為45.37%。NPM1基因突變患者的兩年累計生存率為66.67%，較無突變患者(40.23%)高(χ2=4.770，P=0.029)；DNMT3A基因突變患者的兩年累計生存率為23.53%，較無突變患者(49.45%)低(χ2=3.949，P=0.038)；NRAS基因突變患者與無突變患者的兩年累計生存率(36.00%vs.48.19%)比較，差異無統計學意義(χ2=1.080，P=0.216)。基因突變數目≥3個患者的兩年累計生存率為31.91%(15/47)，基因突變數目<3個的患者(55.74%，34/61)低(χ2=5.806，P=0.012)，見圖2。

圖2 AML患者的總生存曲線

2.7基因突變與患者OS之間的關系：多因素分析結果顯示，NPM1基因未突變、DNMT3A基因突變、基因突變數目≥3個與AML患者較差OS相關(P<0.05)。見表3。

表3 基因突變與患者OS之間的關系

3 討 論

既往研究表明，與年輕成人AML患者相比，老年AML患者的具有的細胞遺傳學和分子生物學預后不良因素比例較高，臨床療效明顯較差，了解老年AML患者的基因突變特征可為進一步理解老年AML的生物學特點及指導臨床治療提供可靠依據[6]。近年來，基因測序技術的發展為臨床分析AML的基因突變提供了便利，越來越多具有臨床意義的基因突變被發現[7]。本研究應用二代測序技術分析了老年AML患者的基因突變情況，研究結果顯示，117例AML患者中，基因突變檢出率達92.31%，且以同時攜帶≥3個基因突變的檢出率最高，與既往研究[8]結果類似，提示AML患者基因突變發生率較高，大部分患者至少攜帶1個基因突變。

3.1AML患者基因突變發生情況分析:本研究中，檢測到的基因突變共涉及67種基因，其中突變檢出率≥10%的突變基因依次為NRAS、NPM1、DNMT3A、TET2、WT1、CEBPA，FLT3-ITD+TKD、GATA2、ASXL1和BCORL1。Prassek等[9]分析了75歲以上老年AML患者的基因突變譜，發現患者基因突變個數的中位數是4個，且以TET2、DNMT3A、NPM1、SRSF2和ASXL1基因為最常見的突變基因，與本研究結果存在差異，考慮與納入對象年齡不同、不同人種基因突變頻率不同有關。呂曉東等[10]在有關AML患者克隆異質性的研究中指出，AML患者檢出的突變基因主要以信號傳導相關基因、表觀遺傳相關基因和轉錄調節相關基因為主，認為疾病早期出現異常基因易導致基因表觀遺傳修飾和轉錄調控等遺傳信息的不穩定性，易造成克隆異質性，影響疾病進展及預后。本研究也發現，AML相關基因突變主要涉及的通路有表觀遺傳學、轉錄調節、細胞增殖或凋亡和剪切因子等，與既往研究結果類似。

3.2部分基因突變對AML患者臨床特征及預后的影響:為明確基因突變與AML患者臨床特征及預后的關系，本研究選擇性分析了NRAS、NPM1和DNMT3A基因與患者臨床特征及預后的關系。研究結果顯示，NRAS基因突變患者HGB水平低于無突變者，NPM1基因突變患者WBC水平高于無突變者；NPM1、DNMT3A基因突變在中危患者中的檢出率高于低、高危患者，提示NRAS、NPM1和DNMT3A基因突變與AML患者的臨床特征存在相關性。NRAS基因可編碼膜蛋白，是一種可將細胞外信號轉至細胞核以調節細胞增殖、分化和凋亡的“分子開關”，其外顯子及密碼子的錯義突變參與了AML的發生發展，而在AML發展過程中，患者骨髓造血功能出現障礙，使機體不能造血，最終影響WBC、HGB等水平。李甜甜等[11]分析了NRAS基因突變在成人AML患者中的表達，也發現合并NRAS基因突變的患者其HGB水平較無突變者低。NPM1基因位于人類染色體5q35上，可以伴侶蛋白的形式促使核糖體合成，并經由抑癌基因p53等調控細胞增殖及調控。肖蓉等[12]報道在老年急性非早幼粒細胞白血病患者中，NPM1基因突變陽性患者的WBC水平顯著高于NPM1基因突變陰性患者，認為NPM1基因突變與CD34、CD117低表達相關，患者免疫功能下降，進而影響WBC的水平。也有研究發現，NPM1、DNMT3A基因突變與患者染色體核型危險度分層之間無相關性，可能與患者年齡組成、遺傳學危險分組及構成不同有關[13]。進一步分析不同基因突變患者的預后情況可知，NPM1基因未突變、DNMT3A基因突變、基因突變數目≥3個與AML患者較差OS相關，提示基因突變數目和類型與AML患者OS存在明顯相關性，因此推測NPM1、DNMT3A等基因突變與基因突變數目可增加AML患者預后不良的危險度，而NPM1基因突變可能與良好預后有關。

綜上所述，AML患者基因突變率較高，基因突變數目和類型與患者臨床特征、預后相關，評估患者基因突變特征可為AML的疾病診斷、治療選擇及風險分層提供有效的參考信息。