多發性骨髓瘤合并侵襲性真菌感染患者外周血淋巴單核比淋巴細胞亞群變化及其與預后的關系

陳麗娟， 張家友， 韓少玲， 吳 晶， 陳園園， 代明輝

(1.成都醫學院第二附屬醫院/核工業四一六醫院， 四川 成都 610051 2.四川省綿陽市第三人民醫院血液科， 四川 綿陽 621000)

多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是一種血液系統原發性的漿細胞性腫瘤，是血液系統中僅次于淋巴瘤發生率排名第二的惡性腫瘤，據研究報告顯示，2016年我國MM患者的發病率約為1.03/10萬人口左右[1]。臨床主要表現為進行性的骨痛、繼發性貧血、腎功能損傷和感染等，嚴重影響患者生存水平。而且MM患者骨髓瘤細胞可以合成大量單克隆免疫球蛋白，抑制機體正常免疫球蛋白的合成，使得患者免疫功能受到損傷導致免疫力下降，引發侵襲性真菌感染(Invasive Fungal Infections,IFI)，對患者的生命安全造成嚴重威脅。MM合并IFI患者常并發多種癥狀累及多個器官，加快疾病進程，因此早期明確MM合并IFI患者疾病進展相關指標，對于判斷疾病預后有重要意義。外周血淋巴細胞與單核細胞比(Lymphocyte-to-Monocyte Ratio,LMR)是可以反映機體免疫狀態的淋巴細胞與單核細胞的比值，其表達與患者免疫系統與腫瘤誘導免疫功能障礙有關[2]。淋巴細胞亞群主要包括T淋巴細胞、B淋巴細胞以及NK淋巴細胞等，其中分別以CD3+、CD19+和CD16+56+較具代表性，其能夠參與免疫應答，與MM的起病和進展關系密切[3]。當前臨床對于MM合并IFI的患者診斷主要是通過病理學、影像學、實驗室等檢查進行確診，未明確準確度高、檢測便捷和操作相對簡單的指標從而對患者預后進行判斷，本研究將分析LMR和CD3+、CD19+和CD16+56+水平在MM合并IFI患者中的表達及其意義，現報道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2016年1月至2018年3月我院收治的MM合并IFI患者105例作為研究對象，選擇MM未合并IFI的患者98例作為對照組。依據Durie-Salmon分期[4](DS分期)分為Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ期59例。DS分期標準：Ⅰ期(符合下列4項)：血紅蛋白>100g/L；血清鈣正常≤3.0mmoL/L；骨骼X線示結構正常或孤立性骨漿細胞瘤；低M蛋白量：免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)<50g/L，免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)<30g/L，24h尿液中本周氏蛋白<4g。Ⅱ期：不符合Ⅰ～期和Ⅲ期的患者。Ⅲ期(符合任意一項或以上)：血紅蛋白<85g/L；血清鈣>3.0mmoL/L；骨骼X線示溶骨性病灶超過3個；高M蛋白量：IgG>70g/L，IgA>50g/L，24h尿液中本周氏蛋白>12g。診斷標準：符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》中關于MM的診斷標準[5]：①MM的診斷：癥狀性MM：骨髓組織活檢測存在漿細胞瘤或者骨髓中單克隆漿細胞的比例超過10%；采用瓊脂糖凝膠免疫固定電泳技術在尿液或血液中檢測出克隆性免疫球蛋白且伴有組織和器官的損害。無癥狀MM：單克隆性免疫球蛋白大于等于30g/L或者骨髓克隆性的漿細胞比重大于等于10%。②IFI的診斷：參照2013年發布的血液病/惡性腫瘤IFI診斷標準與治療原則(第四次修訂版)[6]中診斷依據：在通常無菌而臨床表現或放射學檢查存在感染的部位病理學檢查呈陽性，且在無菌條件下取得的標本培養結果呈陽性或(和)腦脊液經鏡檢出現隱球菌呈陽性，血液真菌培養呈念珠菌、霉菌或酵母菌陽性且具有感染的癥狀體征。納入和排除標準：納入標準：①初診患者；②既往未發生真菌感染者。排除標準：①其他血液系統疾病或代謝性疾病；②合并多個系統器官疾患；③免疫功能障礙或其他感染性疾病。觀察組和對照組患者年齡、性別、M蛋白分型[IgA，IgG，免疫球蛋白D型(Immunoglobulin D，IgD，輕鏈型]和Durie-Salmon分期(DS分期)資料比較差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 觀察組與對照組一般資料比較

1.2方法：采用流式細胞術檢測上述各組外周血淋巴細胞計數和單核細胞計數，計算LMR，測定患者的CD3+、CD19+和CD16+56+水平。具體操作如下：①采集各組患者和健康人晨起空腹靜脈血5mL，分別置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管和生化管中備用。②分別將兩支流式試管編號為a和b，然后各加入熒光抗體各10μL。③將抗凝血置于室溫平衡6h后輕輕搖勻，反向加樣將50μL全血加入試管內，避光在室溫下保存放置15min；取出試管，每管加10倍的稀釋液450μL，混勻。④將試管避光靜置10min，待管內液體澄清透亮后在4℃避光，然后使用流式細胞儀(深圳市默賽爾生物醫學科技發展有限公司，邁瑞BriCyte E6P)測定。

1.3統計學方法：采用SPSS20.0統計軟件對數據進行分析，計量數據比較采用獨立樣本t檢驗，計數數據用構成比表示，進行χ2檢驗，相關性使用Spreaman等級相關性分析法，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)、曲線下面積(Area under the Curve，AUC)、靈敏度、特異度分析各因子對MM合并IFI患者DS分期和預后的診斷及預測價值，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1MM合并IFI患者LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平的表達：觀察組患者外周血LMR和CD19+、CD16+56+較對照組均降低，且CD3+較對照組升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 MM合并IFI患者LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平的表達

2.2DS不同分期MM合并IFI患者血清LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平的表達：DS分期Ⅲ期患者LMR和CD19+、CD16+56+均較Ⅰ～Ⅱ期降低，CD3+顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期MM合并IFI患者LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平表達

2.3外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期的關系：運用Speraman等級相關性分析方法，結果顯示：外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期呈負相關(rs=-0.686、-0.659、-0.661，P<0.01)，CD3+與DS分期呈正相關(rs=0.551，P<0.01)。

2.4外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平對MM合并IFI患者DS分期的診斷價值：經過ROC曲線分析，外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者DSⅠ～Ⅱ與Ⅲ期的分期均有較高效能，LMR≤6.14時診斷MM合并IFI患者DS分期為Ⅲ期的效能最高，敏感度和特異度分別為91.53%和89.13%。見表4和圖1。

圖1 外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者DSⅠ～Ⅱ期與Ⅲ期的ROC曲線圖

表4 LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者DS的ROC分析

2.5MM合并IFI生存組和死亡組患者外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平表達：死亡患者外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平均低于存活組，CD3+水平高于存活組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 MM合并IFI生存與死亡組患者外周血LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平表達比較

2.6外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平對MM合并IFI患者結局的預測價值：經過ROC曲線分析，外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者預后均有較高效能，LMR≤4.02時預測MM合并IFI患者死亡的效能較高，其敏感度和特異度分別為79.56%和88.42%。見表6和圖2。

表6 LMR CD3+ CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者預后的ROC分析

圖2 外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者生存與死亡預后評估的ROC曲線圖

3 討 論

MM屬于一種漿細胞惡性增殖性的血液系統疾病，患者的體液免疫功能和細胞免疫功能均會受到影響，容易導致支氣管、肺部等部位遭受真菌的侵襲，而出現氣道黏膜炎癥、壞死性肺炎等，嚴重影響患者的預后[7]。MM合并IFI患者病情進展迅速，早期及時診治可以有效改善患者的預后，延緩疾病進展，延長患者的生存時間。國外研究[8]發現MM患者在疾病進展過程中體內免疫系統存在缺陷，其中主要包括淋巴細胞、單核細胞以及淋巴細胞亞群中T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK淋巴細胞等的功能缺陷或數量異常。據蒙沙等[9]人的研究也證實低外周血淋巴細胞和低LMR是MM患者預后不良的獨立危險因素。在既往研究基礎上，本研究分析了MM合并IFI患者外周血LMR和淋巴細胞亞群水平的變化，而且明確了上述因子與MM合并IFI患者DS分期進展的關系，能夠在早期指導患者病情的判斷，從而指導臨床治療改善預后。

本研究數據顯示，觀察組患者外周血LMR和CD19+較對照組均顯著降低，且CD3+和CD16+56+均較對照組顯著升高，說明LMR和T淋巴細胞、B淋巴細胞以及NK淋巴細胞參與了疾病的發生和進展。分析原因為LMR作為淋巴細胞和單核細胞的比值，能夠反映患者免疫功能受損和障礙的程度，據袁茂林等[10]的研究報道已經證實患者病情進展與腫瘤免疫微環境關系密切，而且LMR也被發現與乳腺癌患者的臨床分期和轉移有關，這與本研究的方向一致，但本研究明確了MM合并IFI患者外周血LMR較正常健康人水平明顯降低；T淋巴細胞、B淋巴細胞屬于特異性免疫細胞，而NK淋巴細胞和樹突細胞等為固有免疫細胞，腫瘤患者體內的抗腫瘤免疫應答主要是由T淋巴細胞進行介導從而維持機體免疫穩定；而B淋巴細胞可以通過中和、調理和激活補體的方式介導機體的體液免疫應答，其還可以給淋巴T細胞加工提供可溶性抗原。而活化的B細胞能夠分泌多種細胞因子調節機體免疫功能，CD56作為來源于造血干細胞NK淋巴細胞的表面標志物，其可以直接殺傷腫瘤細胞和已經被感染的細胞，當MM發生且集體感染嚴重時外周血NK細胞基數下降。因此，MM合并IFI患者存在體液免疫功能低下和免疫調節功能障礙，外周血LMR和CD19+、CD16+56+顯著降低，且CD3+升高。

上述研究數據還顯示，MM合并IFI患者DS分期重度患者的LMR和CD19+、CD16+56+均低于輕中度組，CD3+高于對照組，而且LMR和CD19+、CD16+56+水平與MM合并IFI患者DS分期呈負相關，CD3+與DS分期呈正相關，說明LMR和淋巴細胞亞群與MM合并IFI患者疾病進展密切相關。分析原因為淋巴細胞對于宿主抗腫瘤和抗感染的防御有重要作用，淋巴細胞計數降低的患者可能使得對惡性腫瘤的免疫反應減弱從而加快腫瘤細胞的增殖，加重疾病進展。桂前樂等[11]關于腫瘤相關性巨噬細胞在MM中的浸潤及其臨床意義的研究中提出，骨髓微環境中的單核細胞能夠抑制宿主抗腫瘤的免疫力和促進腫瘤血管的生成，而且分化成的腫瘤相關巨噬細胞(Tumor Associated Macrophages,TAM)可以通過支持血管的生成以促進腫瘤生長而且還能通過誘導免疫抑制保護腫瘤細胞免于凋亡，骨髓微環境中的TAM與MM的發生、發展密切相關。因此當淋巴細胞低表達且單核細胞增多時，LMR值降低并且反映宿主抑制腫瘤的功能降低，進而加重MM合并IFI患者疾病進展，使患者預后不良。淋巴細胞根據細胞表面分化群可以分為CD3+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞以及CD16+56+NK淋巴細胞等，而CD3+又可分為CD4+輔助/誘導T細胞和CD3+CD8+T即CD8+抑制、殺傷T細胞(即Th細胞、Ts細胞)，上述淋巴細胞亞群相互協作相互制約從而實現機體免疫應答機制，維持機體免疫平衡。袁中健等[12]的研究顯示，MM患者體內抗腫瘤免疫應答主要由T細胞發揮作用，其中CD3+中Th細胞是免疫應答中的主要反應細胞，Th相關細胞因子的異常表達參與了MM的發生發展，這也說明了CD3+的升高與MM的進展關系密切，這與本研究中CD3+與DS分期呈正相關結果一致。而CD8+T細胞是由抑制性T細胞和細胞毒性T細胞組成，然后對靶細胞產生毒性作用，因此，CD3+的升高反映T細胞的抗腫瘤免疫功能受到抑制，從而減輕了其對骨髓中漿細胞的抑制作用，導致漿細胞的進一步增殖加重病情。活化的B細胞可以分泌多種因子調節機體免疫，本研究中MM患者CD19+水平降低，說明隨著DS分期的加重，患者體液免疫功能進一步受到抑制，這與既往研究證實的B淋巴細胞通過誘導成熟蛋白-1的水平與MM預后呈負相關的觀點一致[13]。NK細胞能夠直接殺傷靶細胞從而發揮抗感染、抗腫瘤等作用，其隨著DS分期而逐漸降低反應宿主抗腫瘤能力加重患者病情，導致不良預后。

據外周血LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平指導MM合并IFI患者DS的ROC分析顯示，LMR對于指導鑒別MM合并IFI患者DS嚴重程度和生存與死亡的預后情況的效能更高，說明LMR變化可以用來提示患者病情進展，并指導患者預后情況。分析原因為隨著病原菌的進一步侵蝕，淋巴細胞的耗竭會引起宿主免疫功能的持續下降，造成感染病原體無法及時清除造成機體免疫受損，而且淋巴細胞對于抗腫瘤和抗感染的作用十分重要，其水平一旦降低，便有利于腫瘤細胞的增殖；單核細胞分化而來的TAM可以改變腫瘤微環境同時釋放多種促血管生成細胞因子等進一步促進腫瘤的浸潤、轉移和生長造成免疫抑制等，而且，王毅均等[14]研究表明TAM是判斷結直腸癌患者預后重要指標，高TAM浸潤的患者預后較差，這與本研究的方向一致。所以作為淋巴細胞與單核細胞比值的LMR對于機體免疫功能和疾病進展具有明顯的指導價值，另外，Chen XQ等[15]的研究提出診斷時LMR升高的患者無進展生存期和總生存期更長，認為LMR比單純比較淋巴細胞和單核細胞能更好的反應預后，這也與本研究的觀點一致。LMR可以同時反應腫瘤微環境以及宿主當前的免疫功能水平，更準確地提示患者的預后信息。本研究數據還顯示，MM合并IFI死亡患者外周血LMR、CD19+和CD16+56+水平均顯著低于存活組，CD3+水平高于存活組，說明LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與患者預后密切相關。分析原因為當具有抗腫瘤作用的淋巴細胞計數降低，而有分泌促腫瘤細胞生長的單核細胞計數增多時會導致LMR降低，隨著LMR的進一步下降，宿主抑制腫瘤的功能減弱，加重MM合并IFI患者病情進展；另外，隨著T淋巴細胞CD3+的升高、B淋巴細胞CD19+以及NK細胞CD16+56+的降低使得患者免疫功能低下，而且隨著真菌的入侵，會導致患者出現肺炎等并發癥以及多個器官的損傷乃至死亡，因此，LMR、CD3+、CD19+和CD16+56+水平與患者的預后密切相關。

多發性骨髓瘤合并侵襲性真菌感染患者外周血LMR和CD19+、CD16+56+降低，CD3+升高，其與疾病進展及預后均存在關聯，可以指導鑒別MM合并IFI患者的DS分期和預后。