β-隱黃素對大鼠正畸牙移動模型RANKL RANK OPG通路及破骨細胞形成的影響

王 帥， 常 穎， 席光偉， 沈 娜

(航天中心醫院口腔科， 北京 100049)

正畸指矯正牙齒，解除錯合畸形[1]。隨著錯合畸形發病率的升高，更多的患者為了牙齒美觀而選擇正畸治療來促進牙齒移動，改變牙齒排位[2]。然而牙齒正畸過程中，牙槽骨改建移動到新的位置耗時較久，這嚴重阻礙了患者對正畸治療的接受度和配合度[3]。故如何運用安全有效的方法促進牙移動，縮短正畸治療的時間，是大多數正畸醫師研究的熱點和難點問題。近來研究發現，正畸牙在牙槽骨改建移動過程中，破骨細胞分化成熟及功能調節可促進正畸牙移動[4]。文獻研究發現，骨保護素(osteoprotegerin，OPG)可抑制核因子κB受體活化因子配體(RANKL)與核因子κB受體活化因子(RANK)結合，抑制破骨細胞活化，從而影響破骨細胞的吸收并參與正畸牙牙槽骨的改建和移動[5]。β-隱黃素是從柑橘、南瓜和紅辣椒等水果和蔬菜中攝取的類胡蘿卜素物質，具有改善脂質代謝，預防動脈粥樣硬化，以及阻止癌變等藥理作用[6]，但近來研究發現，β-隱黃素可上調OPG/RANKL比值，阻止成熟破骨細胞的形成，抑制牙周炎大鼠牙槽骨的吸收[7]。本研究推測，β-隱黃素可能對正畸牙治療過程中牙槽骨改建及破骨細胞吸收具有一定的影響，故本研究建立大鼠正畸牙移動模型，采用β-隱黃素進行干預，探究其對正畸牙移動的影響。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動物:SPF級雄性SD大鼠[10～12周齡，體重(320±10)g]，由河北醫科大學動物實驗中心提供[生產許可證號：SCXK(冀)2019-0006]。所有大鼠于本院動物房中飼養，飼養條件：溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，人工照明12h。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑及儀器:β-隱黃素(原料藥，純度99%，批號：472-70-8，廈門研科生物技術有限公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(批號：R20570、R20432、R21250，上海源葉生物科技有限公司)；蛋白提取試劑盒(批號：P0033，碧云天生物技術研究所)；兔抗鼠RANKL單克隆抗體(批號：11682-R128，北京義翹神州科技股份有限公司)；兔抗鼠RANK單克隆抗體(批號：bs-7343R-1，北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗鼠OPG單克隆抗體(批號：WL02078，沈陽萬類生物科技有限公司)；兔抗鼠β-actin單克隆抗體(批號：CB100127M，北京西美杰科技有限公司)；羊抗鼠二抗(批號：SN134，南京生興生物技術有限公司)；電子游標卡尺(型號ACE101-150，東莞市塘廈愛測易電子儀器廠)；顯微鏡(型號CMY-210，南京南派科技有限公司)；蛋白電泳儀、凝膠成像儀(型號1658033、170-8270，美國Bio-Rad公司)等。

1.2方 法

1.2.1大鼠正畸牙移動模型建立及分組給藥:將大鼠按隨機數字表法分為：正常組、模型組、β-隱黃素低(3μg)、中(6μg)、高(12μg)劑量組[7]，每組10只。除正常組外，其余各組參照文獻[8]構建大鼠正畸牙移動模型，具體操作方法為：將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術臺上，精確制取大鼠上頜牙印模，并用石膏灌模后，于雙側上頜第一磨牙及切牙同一水平磨0.3mm深的固位溝，并于上頜前牙與第一磨牙之間安裝鎳鈦拉簧，測量力值約40g，用0.25mm正畸結扎絲結扎上頜兩切牙后，用牙釉質粘結劑輔助粘接加強固定，定期檢查矯治器情況，如有脫落及時補救。安裝矯治器后第1天開始給藥，β-隱黃素低、中、高劑量組分別于大鼠左側上頜第一磨牙近中牙齦黏膜下注射3μg、6μg、12μg的β-隱黃素(將β-隱黃素用生理鹽水配制成濃度分別為0.25g/L、0.5g/L、1g/L的溶液，注射體積12μL)；正常組和模型組注射12μL生理鹽水；每2天給藥1次，連續給藥28d。

1.2.2各組大鼠正畸牙移動距離檢測:各組大鼠均于末次給藥24h后，精確制取上頜印模，進行石膏灌模，并用電子游標卡尺測量石膏模型上，雙側上頜第一磨牙近中面到上頜切牙遠中面的距離，取三次平均值。正畸牙移動距離(上頜第一磨牙近中移動距離)(mm)=牙移動前距離-牙移動后距離。

1.2.3各組大鼠雙側上頜第一磨牙牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE及TRAP染色:各組大鼠在做完正畸牙移動距離后，處死，取雙側上頜第一磨牙牙根處牙周膜及牙槽骨組織，將左側組織剪碎混勻，置于-80℃冰箱中保存備用，其右側組織立即放入4%多聚甲醛中固定24h后，置于10%乙二胺四乙酸中進行脫鈣(6～8周)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋，制備成約4μm厚的切片，按試劑盒說明書分別行HE和TRAP染色，觀察組織變化。

1.2.4各組大鼠牙根破骨細胞計數:取1.2.3項下的TRAP染色切片，隨機選取5張，在牙根處選取5個陽性視野，顯微鏡下計數每個視野壓力側及張力側牙槽骨表面破骨細胞數目，計數結果取平均值。TRAP染色中破骨細胞的胞質呈粉紅至深紅色為陽性。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測RANKL、RANK、OPG蛋白表達:取1.2.3項下-80℃保存左側組織，解凍后用組織勻漿機碾碎勻漿、離心去上清液，蛋白提取試劑盒提取蛋白，進行電泳、轉膜反應，脫脂奶封閉2h，加入一抗[RANKL(1∶1000)、RANK(1∶1000)、OPG(1∶1000)、β-actin(1∶2000)]孵育過夜，加入二抗(1∶5000)孵育2h，化學發光法顯色，凝膠成像儀拍照，以Image-J軟件分析蛋白相對表達。

2 結 果

2.1β-隱黃素對大鼠正畸牙移動距離的影響:與正常組相比，模型組大鼠正畸牙移動距離升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠正畸牙移動距離升高(P<0.05)，且β-隱黃素各劑量組大鼠正畸牙移動距離呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠正畸牙移動距離比較

2.2β-隱黃素對大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE染色形態的影響:HE染色顯示：正常組大鼠牙周組織及牙槽骨結構正常；與正常組相比，模型組大鼠壓力側牙周間隙變窄，牙槽骨表面可見多個破骨細胞于骨吸收陷窩內，且骨吸收陷窩逐漸融合，而張力側牙周韌帶增寬，可見成骨反應，成骨細胞排列在新生骨周圍；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組張力側新骨形成逐漸明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織HE染色圖(200×)

2.3β-隱黃素對大鼠壓力側及張力側破骨細胞數目的影響:破骨細胞前體TRAP染色為紅色。TRAP染色可見，正常組TRAP紅色較淺；模型組壓力側及張力側多核破骨細胞前體TRAP染色呈強陽性，且壓力側TRAP染色較張力側深；β-隱黃素低、中、高劑量組壓力側TRAP染色呈強陽性，張力側TRAP染色呈弱陽性。見圖2、圖3。與正常組相比，模型組大鼠壓力側及張力側牙槽骨表面破骨細胞數目升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠壓力側牙槽骨表面破骨細胞數目差異無統計學意義(P>0.05)，張力側牙槽骨表面破骨細胞數目降低(P<0.05)，且β-隱黃素各劑量組大鼠張力側牙槽骨表面破骨細胞數目呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見表2。

圖2 各組大鼠壓力側牙槽骨表面破骨細胞TRAP染色圖(400×)

圖3 各組大鼠張力側牙槽骨表面破骨細胞TRAP染色圖(400×)

表2 各組大鼠壓力側及張力側牙槽骨表面破骨細胞數目比較

2.4β-隱黃素對大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達水平比較:與正常組相比，模型組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達水平及RANKL/OPG比值均升高(P<0.05)；與模型組相比，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、OPG蛋白表達水平升高(P<0.05)，RANKL/OPG比值降低(P<0.05)，RANK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，且β-隱黃素各劑量組RANKL、OPG蛋白表達水平呈劑量依賴性升高(P<0.05)，RANKL/OPG比值呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、RANK、OPG蛋白印跡圖

表3 各組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL RANK OPG蛋白表達水平及RANKL/OPG比值比較

3 討 論

正畸牙移動的本質是牙周膜重塑和牙槽骨重建過程[9]。壓力側牙槽骨吸收，張力側牙槽骨形成，是正畸牙移動、牙槽骨改建的重要機制[10]。破骨細胞是參與牙槽骨吸收的唯一細胞，其在壓力側牙槽骨中數目增多可促進牙槽骨吸收，加快牙齒移動，但在張力側數目增多，則不利于張力側牙槽骨骨形成及重塑，而易導致骨丟失、牙齒松動及脫落[11]。β-隱黃素可調控成骨細胞骨形成，及破骨細胞骨吸收活性，來預防骨組織喪失、促進骨組織重建，并緩解牙周炎作用[12]。本研究發現，β-隱黃素干預劑量越高，大鼠正畸牙移動距離越高，張力側牙槽骨表面破骨細胞數目降低越明顯，新骨形成也較模型組明顯，而壓力側牙槽骨表面破骨細胞數目與模型組相比無明顯變化，提示β-隱黃素加速正畸牙移動作用，可能是通過抑制張力側牙槽骨表面破骨細胞活性，加速牙槽骨沉積作用來完成的。

RANKL/RANK/OPG信號通路是連接成骨細胞與破骨細胞信號傳遞，影響骨代謝，參與牙周膜重塑和牙槽骨重建的關鍵通路。RANKL可與RANK結合促進破骨前體細胞形成、成熟及分化，成熟的破骨細胞可產生鹽酸溶解骨礦物質，啟動骨吸收，形成骨窩陷；OPG是成骨分化因子，其N端的D1-D4功能區可競爭性結合RANK，阻斷RANKL與RANK結合而抑制破骨細胞骨吸收過量，利于牙根穩定[13]。大量文獻研究發現，在牙槽骨吸收活躍區域，上調OPG表達，改變RANKL/OPG比值，可維持牙槽骨重建中骨形成與骨吸收的動態平衡，張瑞林等[14]發現RANKL/OPG比值控制在2.33以內，可使正畸牙有效移動并防止牙根過量吸收。本研究發現，β-隱黃素低、中、高劑量組大鼠牙根處牙周膜及牙槽骨組織RANKL、OPG蛋白表達均較模型組升高，RANKL/OPG比值回降至正常水平，但RANK蛋白變化不明顯，推測β-隱黃素藥物作用，可能通過上調OPG表達，來競爭性結合RANK，從而使RANKL與RANK結合受抑制，達到促進RANKL/OPG破骨骨吸收及成骨形成的動態平衡的目的，這就解釋了β-隱黃素干預治療后張力側牙槽骨表面破骨細胞數目減少，正畸牙移動距離較大的原因。

綜上所述，β-隱黃素可能通過上調RANKL及OPG表達，降低RANKL/OPG比值，阻斷RANKL與RANK結合，促進矯正牙移動，抑制破骨細胞進一步活化，來維持牙周膜重塑和牙槽骨重建中成骨形成與破骨吸收的動態平衡。為臨床闡明正畸牙移動的分子機制和β-隱黃素的開發應用提供一定的參考。但β-隱黃素調控破骨骨吸收及成骨形成動態平衡的作用機制還需用通路抑制劑來進一步驗證。