桑屬植物總RNA的提取及花青素合成基因MCHS的鑒定

李姣玉，邢玉薪，姚悅璠，劉開創，康少博，楊 艷

（1.太原科技大學 化學與生物工程學院，山西 太原 030006；2.福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350000；3.哈爾濱醫科大學 生命信息學院，黑龍江 哈爾濱 150000）

植物組織中總RNA 的提取是分子生物學研究的基本手段之一，基因獲得、cDNA 文庫、Northern 印跡、基因轉錄調控等現代生物技術手段均需以高質量的RNA 為前提。目前的RNA提取方法有Trizol、CTAB法、SDS-酚等，但目前桑科植物總RNA 提取報道相對較少[1-2]。桑果中含有大量的花色素苷類物質，該物質具有防止UV、病原菌對植物產生傷害，調節生長素在植物體內的運輸，消除動植物細胞內氧自由基、消炎、抗癌等多種功能[3]。

研究表明，類黃酮等花色素的生物合成途徑包含3 個階段。首先，苯丙氨酸脫氫酶（Phenylalanine dehydrogenase,PAL）催化苯丙氨酸為肉桂酸，經肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamic acid 4 hydroxylase,C4H）、4-香豆酰輔酶A 連接酶（4-Coumarate coenzyme A ligase,4CL）催化，生成香豆酰輔酶A（P-Coumaroyl-CoA）；其次，查爾酮合成酶（Chalcone synthase,CHS）催化香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）生成柚皮素查爾酮，即查爾酮，查爾酮再經查爾酮異構酶（Chalcone isomerase,CHI）催化轉化成柚皮素；最后，黃烷酮3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase,F3H）進一步催化為二氫黃酮醇化合物，在二氫黃酮醇還原酶（Dihydroflavonol 4-reductase,DFR）、花青素合成酶（Anthocyanidin synthase,ANS）催化作用下，分別形成天竺葵素、矢車菊素和翠雀素等物質。報道表明，CHS、CHI 和F3H 是花青素形成所必需，其抑制或過表達均會影響植物最終的花色及抗逆性狀態等[3]，見圖1。

圖1 花青素生物合成途徑Fig.1 The biosynthesis pathway of anthocyanins

本研究以桑葉及果實為試驗材料，通過改進和優化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑葉MCHS基因或類似MCHS基因本研究以桑葉及果實為試驗材料，并改進優化Trizol 法提取RNA 及克隆桑葉MCHS基因，其不僅有助于從分子水平研究桑科類黃酮代謝機制，還為研究MCHS的進化、桑葚花青素提取、合成與鑒定等提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試驗用品處理

樣品：新鮮桑葉及其果實。5 月底—7 月初，采集于太原科技大學南校區，-80℃冰箱保存備用，用于總RNA提取。

試驗所用試劑均由滅菌的0.1%DEPC水配制；研缽、玻璃器皿等由0.1%DEPC 水處理24 h后，進行20～30 min的高壓滅菌；氯仿、苯酚等藥品均為分析純；Trizol 試劑為上海生物工程有限公司產品；逆轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購自寶生生物有限公司。

本試驗所用PCR引物根據收錄于NCBI上的桑科CHE設計，NCBI 登錄號：KT630885，具體序列見表1，引物序列由北京華大基因有限公司合成。

表1 擴增MCHS基因引物序列Tab.1 Primer of MCHS gene

1.2 試驗方法

1.2.1 Trizol法提取總RNA

取0.1 g新鮮樣品放入液氮預冷的研缽中，邊加液氮邊研磨，直至細粉狀為止；預先在離心管中加入1 mL Trizol 溶液，迅速將研磨好的細粉加入離心管中；立即用振蕩器振蕩2 min，隨后在室溫下振蕩10 min，靜止數秒后，放入冰箱冷藏，使溫度降為4℃，離心5 min，轉速為12 000 rpm；預先在新離心管中加入200 μL 氯仿，將上清液迅速轉移至離心管，立即振蕩2 min，隨后在室溫下振蕩5 min，靜置2 min后，放入冰箱冷藏，使溫度降為4 ℃，然后離心10 min，轉速為12 000 rpm；于新離心管中加入200 μL 氯仿，將上清液迅速轉移至離心管，快速振蕩15 s，放入冰箱冷藏，使溫度降為4℃，然后離心10 min，轉速為12 000 rpm；預先在新的離心管中加入500 μL異丙醇，將上清液迅速轉移至離心管，緩慢顛倒離心管；-80℃下沉淀1h；從冰柜中取出含有RNA 沉淀的離心管，在4℃的條件下離心10 min，轉速為12 000 rpm，小心棄上清；隨后加入1 mL 75%乙醇，振蕩器振蕩，在4℃下離心5 min，轉速為12 000 rpm，小心棄上清，短暫離心后用移液槍吸去剩余上清，超凈臺自然干燥2 min，加入16 μL DEPC 處理后重新溶解。

1.2.2 RT-PCR擴增MCHS基因

使用Takara 公司的PrimeScript ?RT reagent Kit with g DNA Eraser 試劑盒，將所提取的桑葉總RNA 反轉錄為cDNA并以該cDNA 為模板進行PCR 檢測，PCR 引物為反應體系為（20 μL）為：10×PCR buffer 4.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）2.0 μL，下游引物（10 μmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.5 μL，反轉錄產物2 μL，ddH2O 9 μL。反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30 個循環；72℃延伸10 min，4℃保存備用。取5 μL 擴增產物，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結果。

1.3 總RNA的完整性及質量檢測

1.3.1 電泳檢測

DEPC 水稀釋TAE 后，取2 μL 的RNA 樣品與1 μL 溴酚藍混合后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時間為30 min，電壓為100 V，在紫外凝膠成像系統上對RNA 條帶的清晰度和完整性進行觀察，并拍照記錄。

1.3.2 RNA質量檢測

參照奧斯伯等的方法，取10 μL總RNA溶液，加DEPC 水稀釋至1 mL，分別在230 nm、260 nm 和280 nm 處測量吸光值。并計算A260/A280、A260/A230的比值。

RNA產量（μg）=RNA濃度（μg/mL）×VDEPC－H2O（mL）

2 結果與討論

2.1 Trizol法提取的桑葉及果實中總RNA的質量分析

見圖2，使用Trizol 法從桑葉及桑葚中均可以提取出總RNA，但通過電泳分析發現，在條帶完整性和強度上，從葉和果中獲得的RNA 存在差別。果實中因糖、酚含量較高，28 s和18 s 條帶較模糊，且無5.8 s，同時放置一周后，樣品組織中RNA大部分降解。

圖2 桑葉與桑果總RNA電泳檢測Fig.2 Electrophoresis for total RNA of mulberry leaves and mulberry

桑葉中提取的RNA 條帶完整，帶型較好，未發生明顯的降解，28 s 的亮度是18 s 的2 倍左右，并且5.8 s 亮度較弱，說明該樣品的完整性良好。

2.2 Trizol法提取的總RNA純度和得率

從表2 可以看出，提取自桑葉中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值在1.8～2.0，可說明未受蛋白質或酚類污染；而提取自桑果中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值＜1.8，說明受蛋白質及其他有機物污染較明顯。在后續的RTPCR 試驗中，使用無污染的桑葉RNA 進行反轉錄及MCHS基因擴增。

表2 Trizol法提取的RNA的純度及得率Tab.2 Isolated RNA purity and yield by Trizol methods

2.3 桑葉MCHS基因的鑒定

以提取的桑葉總RNA 為模板進行RT-PCR 檢測，引物是根據NCBI上已收錄的桑科CHE設計2對簡并引物MCHS（1-393）、MCHS（36-393），其中MCHS（1-393）擴增為查爾酮酶基因的全長序列，MCHS（36-393）擴增的為查爾酮酶的關鍵區域，RT-PCR 結果，見圖3。從桑葉RNA 中獲得的查爾酮合成酶基因全長序列為1 200 bp 左右，關鍵區域序列為1 000 bp左右，序列大小與大多數物種CHS相似。

圖3 桑葉提取MCHS基因擴增結果Fig.3 MCHS by RT-PCR isolated from mulberry leaves

3 結論

山西桑屬資源豐富，研究報道表明，桑屬資源含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質等；同時桑果還具有補肝益腎、補血養顏等功效。以桑葉作為研究對象，對其細胞水平進行深入研究，其結果對于山西省桑葚的種植、開發與推廣具有重要實踐性意義。

在桑屬植物的類黃酮生物合成過程中，MCHS是第一關鍵酶，對其抑制或過表達將直接影響苯丙氨酸和丙二酰-CoA的結合，從而影響花色素合成、抗病性以及抗UV 性等。有研究表明，利用RNA 干擾技術使花素夏堇中的CHS 基因沉默，或矮牽牛CHS基因突變，均可獲得花色花粉不同的新品種[6]。

本研究以桑葚為試驗材料，通過改進和優化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑葉MCHS基因，Trizol 法提取桑科RNA操作簡單，結合氯仿、苯酚等提取試劑，提取時間為2～3 h。該方法具有可重復性強、提取RNA 完整性好等優點，所提取RNA 可直接進行后續的RT-PCR 反轉錄試驗，不需要DNase消化，因此是植物RNA 的理想提取方法之一，該結果為分子水平上揭示花青素的形成機理奠定基礎。