粗糠柴霉素通過調控PAK6基因的表達對非小細胞肺癌細胞A549增殖、凋亡以及放射敏感性的影響

穆雙鋒 李敬霞 龐然然

肺癌是五大癌癥之一，世界上最常見的癌癥，也是死亡率最高的癌癥。主要分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer cell，NSCLC)和小細胞肺癌，兩者在肺癌中占比分別為85%和15%。肺癌的治療手段主要是手術、放射、化療和分子靶向藥物治療的方式，通常患者常接受兩種或兩種以上的治療方式[1]。粗糠柴霉素，即Rottlerin，是一種提取自印度和中國傳統中藥材粗糠柴的化合物，具有驅絳蟲、治療疥瘡和皰疹的癬的作用。粗糠柴霉素是蛋白激酶 C(protein kinases C, PKC)的選擇性抑制劑[2]。近年的研究發現，粗糠柴霉素針對很多腫瘤都有抑制作用，其在乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌的治療研究中都發現有顯著的抑癌效果[3-7]。p21活化激酶(p21-activated kinase 6，PAK6)在肺癌、結腸癌等癌組織中都有過量表達，促進腫瘤發展[8-10]。干擾PAK6表達可以誘導乳腺癌細胞的凋亡，增強乳腺癌細胞的放射敏感性[11]。本研究以NSCLC A549細胞為研究對象，以不同濃度粗糠柴霉素處理和過量表達PAK6的方法來檢測粗糠柴霉素抑制A549細胞增殖、促進凋亡的作用機制和對放射敏感性的影響，探尋粗糠柴霉素對抑制非小細胞肺癌的臨床意義。

資料與方法

一、材料

人非小細胞肺癌細胞系A549購自ATCC；DMEM培養基(dulbecco's modified eagle medium)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司，胰蛋白酶Trypsin、四氮唑藍(MTT)和二甲基亞礬(Dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma-Aldrich公司；雙抗、抗PAK6抗體和抗GAPDH抗體購自Abcam公司；Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；雙染色流式法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

二、方法

1 細胞培養：A549細胞在10 % FBS+DMEM培養基+1% 青霉素+1% 鏈霉素的細胞培養液中，37℃ 5% CO2環境中常規培養。待細胞生長融合成單層時，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)清洗三次，再用Trypsin消化傳代。

2 MTT實驗測定細胞增殖抑制率：將終濃度為0、2、4、8、16 μM的粗糠柴霉素加入A549細胞，連續培養24 h、48 h、72 h，加入 20 μL(5 g/L)MTT，反應4 h后加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min溶解甲瓚結晶，在Bio-Rad全自動酶標儀測定OD492 nm 處的吸光度(A)值，計算抑制率(%)=(對照組A均值-實驗組A均值)/實驗組A均值×100%。并確定半數抑制濃度的粗糠柴霉素最佳處理時間。

3 細胞轉染：將A549細胞稀釋為密度1×106個/mL，接種于6孔板中(200 μL/孔)，待細胞生長融合成一層時按照Lipofectamine 2000說明書的步驟，將Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-PAK6在無血清OptiMEM培養液中稀釋，之后取等體積Lipofectamine 2000和pcDNA或pcDNA-PAK6輕輕混勻，靜置20 min，將混合液加至6孔板中，輕輕晃動6孔板，混合均勻后置培養箱中繼續培養6h，之后換成完全培養基，轉染48h后收集A549細胞進行后續實驗。細胞分為對照組、粗糠柴霉素組(8μM粗糠柴霉素處理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA組(轉染pcDNA后經8μM粗糠柴霉素處理48 h)、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組(轉染pcDNA-PAK6后經8μM粗糠柴霉素處理48 h)。

4 Real-timePCR檢測mRNA的表達：按照Total RNA提取試劑盒的說明書，進行各組A549細胞總RNA的提取，測定濃度和純度后保存于-80℃超低溫冰箱。通過反轉錄PCR試劑盒制備cDNA，real-time PCR試劑盒在Bio-Rad Real-time PCR儀，按照95℃ 7 min；95℃ 40s、58℃ 42s、72℃ 35s(35個循環)；72℃ 10 min的程序進行反應，Bio-Rad公司的IQ5TM Real-time PCR Detection System分析數據。PAK6 上游引物 5′-GACTCCATCCTGCTGACCCTC-3′，下游引物 5 ′-CACCTCAGTGGCATACAAAGACC-3′；GAPDH(內參照)上游引物 5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

5 流式細胞術測定細胞凋亡率：收集各組A549細胞，遵循Annexin V/PI 試劑盒說明書的指示，以5 μL膜聯蛋白V-FITC標記的 (Annexin V-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(PI)避光染色，15 min后在流式細胞儀分析細胞凋亡率。

6 克隆形成實驗測定放射處理后細胞存活分數：取各組A549細胞細胞濃度稀釋至1×104個細胞/孔，接種于6孔培養板培養過夜。然后將細胞分別暴露于不同劑量下(0、2、4、6、8Gy)進行照射處理，照射條件：室溫照射，靶距100 cm，照射面積12.5 cm×8.5 cm，美國VarianX直線加速器。取500個細胞/皿接種于細胞培養皿中，設3個重復，加入10mL培養液混合均勻，于37℃ 5% CO2培養箱中培養，培養至出現肉眼能清晰可見的細胞克隆(約2周)，棄去培養液，洗滌2次，4%冷的甲醛固定細胞15 min，棄固定液，洗滌2次，吉姆薩染色30 min，自來水清洗，室溫晾干后計數，所形成的細胞集落>50個時為有效菌落。根據單機多靶模型擬合細胞存活曲線，計算放射增敏比(SER)。計算細胞克隆形成率 = (細胞克隆數平均值/鋪板細胞總數)×100%，細胞存活分數(survival fraction,SF) = 受照射細胞克隆形成率/對照細胞克隆形成率)×100%。

7 Western blot檢測蛋白表達：將對照組、粗糠柴霉素組、粗糠柴霉素+pcDNA組、粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組A549細胞加入RIPA，超聲破碎抽提蛋白。蛋白以4 ∶1的比例加入5×上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，進行SDS-PAGE，轉到硝酸纖維素膜，封閉后于4℃與500倍稀釋的一抗PAK6孵育過夜，于室溫與1 000倍稀釋的二抗孵育1h，顯影后凝膠成像系統掃描，以GAPDH 為內參照，分析PAK6表達水平。

三、統計學處理

結 果

一、粗糠柴霉素抑制A549增殖

粗糠柴霉素處理A549 24 h、48 h、72 h，MTT實驗結果顯示：與粗糠柴霉素0μM組相比，2、4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h細胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素2μM組相比，4、8、16 μM粗糠柴霉素在24 h、48 h、72 h細胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素4μM組相比，8、16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h細胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；與粗糠柴霉素8μM組相比，16μM粗糠柴霉素在24h、48h、72h細胞抑制率均顯著升高(P<0.05)；粗糠柴霉素抑制肺癌細胞生長的作用隨著給藥劑量的增加和處理時間的延長而逐漸增強(P<0.05)(見表1)。根據實驗結果，選取處理時間48h，抑制率為50%左右的粗糠柴霉素濃度(8μM)用作后續實驗。

表1 不同濃度粗糠柴霉素對肺癌細胞A549抑制率的影響

二、粗糠柴霉素促進A549凋亡

流式細胞術實驗結果顯示，與對照組凋亡率相比，8μM粗糠柴霉素處理A549細胞48h后肺癌細胞A549的凋亡率顯著增加(P<0.05)(見圖1和表2)。

圖1 流式細胞術檢測粗糠柴霉素處理后A549細胞凋亡率

表2 粗糠柴霉素對肺癌細胞A549凋亡的影響

三、粗糠柴霉素增加A549的放射敏感性

克隆形成實驗結果表明，與對照組相比，隨著照射劑量的增加，粗糠柴霉素組A549的細胞存活分數逐漸下降，且差異顯著(P<0.05)(見圖2)，放射增敏比為1.663，表明粗糠柴霉素可增加A549的放射敏感性(見表3)。

圖2 不同劑量照射后A549細胞的存活曲線注：與對照組比較，*P<0.05

四、粗糠柴霉素抑制A549中PAK6蛋白的表達

qRT-PCR和Western blot的結果表明，與對照組相比，粗糠柴霉素處理組A549細胞中PAK6的mRNA和蛋白的表達量均顯著降低(P<0.05)(見圖3、表3)。

圖3 A549中的PAK6蛋白表達水平

表3 粗糠柴霉素對肺癌細胞A549中PAK6表達的影響

五、PAK6蛋白過表達逆轉了粗糠柴霉素抑制A549增殖和促進凋亡的作用

Western blot結果表明，與粗糠柴霉素組和粗糠柴霉素+pcDNA組相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組的PAK6蛋白表達量顯著升高(見圖4)。

MTT和流式細胞術實驗結果表明，粗糠柴霉素組細胞抑制率和凋亡率均顯著高于對照組(P<0.05)；粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組細胞抑制率和凋亡率均顯著低于粗糠柴霉素+pcDNA組(P<0.05)(見表4)。

圖4 A549細胞中的PAK6蛋白過量表達

表4 PAK6過表達逆轉了粗糠柴霉素對肺癌細胞A549增殖、凋亡的作用

六、PAK6過表達逆轉了粗糠柴霉素對A549的放射增敏作用

克隆形成實驗表明，與對照組相比，隨著照射劑量的增加，粗糠柴霉素組A549的細胞存活分數逐漸下降，且差異顯著(P<0.05)；與粗糠柴霉素+pcDNA組相比，粗糠柴霉素+pcDNA-PAK6組的細胞存活分數顯著升高(P<0.05)(見圖5)。說明PAK6過表達逆轉了粗糠柴霉素對A549的放射增敏作用。

圖5 不同劑量照射后A549細胞的存活曲線

討 論

肺癌位居世界癌癥首位，非小細胞肺癌占肺癌患者85%左右，多數患者確診時已為肺癌晚期，失去了手術根除的最佳治療機會，所以肺癌的發病率和死亡率接近，目前，手術治療、放射、化療和分子靶向藥物治療是肺癌的最主要治療方式[1]。

粗糠柴霉素被眾多研究證實，對乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肝細胞癌[5]、胃癌[6]、非小細胞肺癌[7]有抗腫瘤作用，本研究證實了粗糠柴霉素在適當濃度抑制非小細胞肺癌細胞增殖的作用，證實粗糠柴霉素對非小細胞肺癌具有潛在的臨床抑制作用。

柯蒙等研究表明，粗糠柴霉素通過下調低密度脂蛋白相關受體6(LRP6)抑制前列腺癌細胞PC-3的經典Wnt通路，實現抑制腫瘤發展的目的[4]。Yin等研究乳腺癌時，得出結論：粗糠柴霉素通過抑制S 期激酶相關蛋白 2(S-phase kinase associated protein 2，SKP2)表達，達到抑制乳腺癌的目的[3]。Zhao 等人發現粗糠柴霉素通過抑制 Hippo 通路中TAZ蛋白的表達，達到抑制非小細胞肺癌的作用[7]。本研究結果發現粗糠柴霉素是通過抑制PAK6表達來促進A549凋亡，抑制非小細胞肺癌細胞增殖的。本研究結果與上述研究結論相似，都表明粗糠柴霉素是通過下調癌細胞中某些信號通路蛋白表達，來發揮增殖抑制和凋亡促進的功能。蔡松旺發現，PAK6 通過重構細胞骨架抑制非小細胞肺癌的侵襲及遷移能力[12]；本研究結果與蔡松旺的結果互補，同時證實了PAK6是通過抑制細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡，進而達到抑制非小細胞肺癌的作用。本研究還發現，粗糠柴霉素可以作為非小細胞肺癌潛在的放射增敏劑。

Brahma 等發現粗糠柴霉素可誘導胰腺癌干細胞自噬導致細胞死亡[13]。QI等人研究發現，粗糠柴霉素通過阻滯細胞周期，同時產生大量內源性微管相關蛋白 1 輕鏈3(LC3)-II 蛋白以及自噬小體，通過誘導細胞發生自噬促進膀胱癌細胞的凋亡[14]。Wnt通路在生長發育和疾病發生過程中具有重要的作用，與各種癌癥的發生和發展更是密切相關[15-17]。PAK6可能通過Wnt通路和/或Hippo 通路影響A549的增殖、侵襲、凋亡，而粗糠柴霉素可能通過調節PAK6表達來影響Wnt通路和/或Hippo 通路，從而抑制細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡或產生細胞自噬，最終達到抑制非小細胞肺癌的作用。這些作用并不是通過單個信號通路或分子標靶來實現的，多個分子機制的參與，使這一過程的研究充滿了挑戰，也為粗糠柴霉素成為臨床抗腫瘤藥物奠定了理論基礎。下一步將從這幾個方向著手研究粗糠柴霉素影響非小細胞肺癌A549細胞增殖、侵襲、凋亡的分子機制，探討粗糠柴霉素作為潛在的放射增敏劑在抑制非小細胞肺癌中的作用機制。