LncRNA MEG3及miR-15a-5p在慢性阻塞性肺疾病中的表達及臨床意義

魏小婉 魯美霞 高佳男 李曉博 楚荷瑩

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是呼吸系統發病率最高、影響力最大的一種疾病，簡稱為慢阻肺[1-3]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度超過200nts的非編碼轉錄本，雖不能表達遺傳信息但在細胞生物學行為及疾病的發生過程中都有十分關鍵的影響[4-5]。研究顯示慢阻肺患者的lncRNA表達水平與健康者有十分大的差別[6-9],其中就包括lncRNA MEG3。微小RNA(microRNA )是一種內源性非編碼RNA，它可以裂解mRNA使其失活并抑制翻譯過程[10], 研究表明lncRNA可通過與miRNA相互作用參與多種病理過程[11]。有研究顯示慢阻肺患者miR-15b-5p的表達高于不吸煙的健康者[12-13]，本研究通過ENCORI(The Encyclopedia of RNA interactomes)數據庫預測出miR-15a-5p可與lncRNA MEG3相互作用。miR-15a-5p與miR-15b-5p同為miR-15家族[14]具有相似的生理作用。因此筆者預測lncRNA MEG3也可能通過miR-15a-5p介導慢阻肺的發生發展。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年8月至2021年4月在鄭州大學第一院就診的慢阻肺患者共43例，其中急性加重期28例，穩定期15例及健康者26例。

1 慢阻肺組入組標準：(1) 根據2020年GOLD[3]中慢阻肺的診斷標準確診為慢阻肺者。(2)急性加重期患者來源于鄭州大學第一附屬醫院呼吸內科病房的住院病人，具有明顯的胸悶、喘息等臨床癥狀，且有因慢阻肺急性加重住院治療的需求。(3)穩定期患者處于疾病穩定期，沒有呼吸道癥狀短期內迅速變差，并且3個月內無口服皮質醇類或抗生素史。

2 慢阻肺組排除標準：(1)患有呼吸系統的其他疾病(如哮喘、處于活動期的肺結核、肺膿腫、肺間質纖維化、肺癌等)。(2)患有嚴重的肝功能衰竭，腎功能損害，心、腦血管疾病及惡性腫瘤等。(3)年齡超過85歲或小于18歲。

3 對照組：選取同期于我院檢查并符合排除標準的健康者26例為對照組，入選者均無呼吸系統疾病。

本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，倫理審查編號：2021-KY-0472-003，所有患者均獲得知情同意。

二 、材料與試劑

見表1。

表1 材料與試劑

三、實驗方法

1 血液標本采集處理：使用EDTA抗凝采血管采集所納入的慢阻肺患者入院24小時內及同期健康對照組外周靜脈血標本3～5mL，以4℃、1500rpm的速率離心10min，棄上清。血細胞用紅細胞裂解液(北京 索萊寶)裂紅2次后加入2mL無血清凍存液(蘇州 新塞美)，移至凍存管中編碼封裝，于-80℃冰箱中冷凍保存。

2 使用qRT-PCR法檢測LncRNA MEG3的表達水平：將細胞從-80℃冰箱中取出后迅速放置于37℃恒溫水浴鍋中使細胞復蘇，按照試劑說明書提取總RNA(使用總RNA快速提取試劑盒 北京 博邁德)，再根據cDNA合成試劑盒(北京 康為)逆轉錄合成cDNA。最后按照qRT-PCR試劑盒(美國 Everbright)的使用說明，加入PCR所需試劑，在qRT-PCR儀器(美國 Thermo Fisher)上進行操作，所有樣本均重復三次。以GAPDH表達水平作為內參照，各組患者LncRNA MEG3的表達量均采用2-ΔΔCt法計算。引物列表如下：lncRNA MEG3-F primer：GCCCTGACCTTTGCTATGCT； lncRNA MEG3-R primer：TCGACAAAGACTGACACCCC；GAPDH F primer：TGACCACAGTCCATGCCATCAC；GAPDH R primer：GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA。

3 使用qRT-PCR法檢測miR-15a-5p的表達水平：細胞復蘇及總RNA提取同上，采用加Poly(A)尾法使用miRNA cDNA合成試劑盒(北京 康為)逆轉錄合成cDNA。同樣根據miRNA qRT-PCR試劑盒(北京 康為)使用流程，在 PCR儀上進行反應，所有樣本均重復三次，以U6表達水平作為內參照，各組患者miR-15a-5p的表達量均采用2-ΔΔCt法計算。引物列表如下：hsa-miR-15a-5p F primer: CCCTAGCAGCACATAATGGTTTG；hsa-miR-15a-5p R primer: 試劑盒通用引物；U6 F primer: CTCGCTTCGGCAGCACA；U6 R primer: AACGCTTCACGAATTTGCGT。

4 采集各入組患者臨床資料：包括入院24小時內檢驗結果、慢性阻塞性肺疾病評估測試問卷(CAT)評分，48小時內我院肺功能檢查結果。

四、統計學處理

結 果

一、三組患者基本資料、實驗室檢查及肺功能指標等比較

急性加重組與穩定期組及健康對照組相比，男性多于女性，年齡較大，且BMI相對偏低。急性加重組GOLD分級多為重度、極重度，穩定期組多為輕、中度，兩者具有顯著不同。急性加重組CAT評分顯著高于穩定期組。肺功能檢查指標均低于處于穩定期組患者，去年急性住院中位次數多于后者(見表2)。

二、各組患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p指標慢阻肺組LncRNA MEG3相對表達量為1.43±1.29，高于對照組1.0±0.00(P=0.043)；miR15a-5p相對表達量為0.63±0.48，低于對照組1.0±0.00(P=0.001)。

表2 三組患者基本資料、實驗室檢查及肺功能指標等

將慢阻肺組分為急性加重組與穩定期組，比較三組患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p的相對表達。急性加重組LncRNA MEG3相對表達量為1.67±1.55，穩定期組為0.99±0.29，急性加重組高于穩定期組(P=0.04),也明顯高于對照組(P=0.16)。急性加重期miR-15a-5p相對表達量為0.60±0.39，穩定期為0.67±0.60，急性加重組明顯低于對照組(P<0.001)。(見圖1，2)。

圖1 三組患者LncRNA MEG3表達量注：*P<0.05

圖2 三組患者miR-15a-5p表達量注：*P<0.05,****P<0.001,nsP>0.05

三、慢阻肺患者LncRNA MEG3、miR-15a-5p及其與臨床指標相關性分析

慢阻肺患者中LncRNA MEG3表達水平與miR-15a-5p成負相關(r=-0.396，P=0.02)，與CAT評分及C反應蛋白成正相關(r分別為0.478，0.508，P分別為0.002，0.003)，與是否吸煙、住院時長、GOLD分級、肺功能指標等均無相關性(圖3-5)。

圖3 LncRNA MEG3與miR-15a-5p相關性

圖4 LncRNA MEG3與CAT評分相關性

圖5 LncRNA MEG3與CRP相關性

四、ROC曲線及Logistic回歸分析LncRNA MEG3及miR-15a-5p對慢阻肺患者的診斷能力

應用ROC曲線分析LncRNA MEG3診斷出慢阻肺的最佳臨界值為0.804，曲線下面積為0.661(95%CI0.5239～0.7981)，靈敏度及特異度分別為76.92%及60%。應用ROC曲線分析miR-15a-5p診斷出慢阻肺的最佳臨界值為0.56，曲線下面積為0.66(95%CI0.490～0.834)，靈敏度及特異度分別為50%及77.27%。應用LncRNA MEG3聯合miR-15a-5p診斷出慢阻肺的曲線下面積為0.721(95%CI0.5755～0.8669)，靈敏度及特異度分別為81.82%及55%(詳見圖6～8)。單因素二元Logistic回歸分析確定了幾個影響慢阻肺發生的重要因素(因變量：慢阻肺組賦值為1，對照組賦值為0；自變量：男性賦值為1，女性賦值為0；吸煙賦值為1，不吸煙賦值為0，分類協變量以取值水平最小的作為參照)。進一步多因素Logistic回歸分析其中吸煙為慢阻肺發生的危險因素(OR20.239，95%CI0.904～11.066，P=0.001)，miR-15a-5p為保護性因素(OR0.029，95%CI1.140～9.718，P=0.002)(見表3)。

表3 Logistic回歸分析影響慢阻肺發生的因素

圖6 LncRNA MEG3診斷COPD的ROC曲線

圖7 miR-15a-5p診斷COPD的ROC曲線

圖8 LncRNA MEG3聯合miR-15a-5p診斷COPD的ROC曲線

討 論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)大多是由于暴露于有害氣體引起的，其病理改變為氣道內持續慢性高炎癥水平造成肺泡結構破裂融合、血管內皮受損、血管管壁增厚管腔狹窄，主要臨床特征為長期連續的氣流受限(不能完全恢復)[3]，許多因素參與了慢阻肺的發展過程，但是具體詳細的分子通路還不完全清晰。由于高通量測序技術日漸成熟，生物信息技術被越來越多的應用于醫學領域，人們不斷發現出與慢阻肺相關的LncRNA[15]，研究表明lncRNA1(SALRNA1)可通過同時調控SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a兩條信號通路，介導肺泡Ⅱ型肺泡上皮細胞的衰老[16]；Tang等通過收集慢阻肺患者和非慢阻肺患者的肺組織，經基因芯片技術挖掘與慢阻肺發病相關的lncRNA，發現lncRNA MEG3與LncRNA TUG1顯著上調表達[17]。LncRNA TUG1可通過上調α-SMA和纖維蛋白的表達，抑制人肺上皮細胞和肺成纖維細胞的增殖[17]，并抑制慢阻肺中miR-145-5p/DUSP6軸來促進氣道重塑[18]。研究表明lncRNA MEG3可通過miR-218介導CRP、IL-1β、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1等炎癥因子的表達來調節香煙煙霧誘導的肺內皮細胞凋亡和炎癥反應[9]。本研究發現慢阻肺患者外周血中lncRNA MEG3表達水平高于健康者，與穩定期組相比急性加重組lncRNA MEG3表達升高尤為突出，并且與炎癥因子CRP成強正相關，與CAT評分成正相關。這與既往研究結果相符，表明lncRNA MEG3可能通過促進CRP等炎癥介質的產生參與了慢阻肺的發生發展，并且lncRNA MEG3水平越高則患者癥狀及疾病嚴重程度越重。

據報道miRNA可以負向調節mRNA并抑制翻譯過程，從而可以根據不同的細胞類型，不同程度的抑制蛋白質輸出至能起作用的最佳水平[19-20]。其中miR-15a-5p不僅在包括腎癌、肝細胞癌、子宮內膜癌等惡性腫瘤發生中起重要作用[21-22]，通過調節人體內巨噬細胞的炎癥反應參與敗血癥的發生[23]，還可以通過調控VEGF/p38/MMP-2信號通路誘導肺動脈高壓的發生[24]。但其在慢阻肺中的作用尚不清楚。越來越多證據表明lncRNA MEG3通過與miRNA相互結合發揮作用，本研究通過ENCORI數據庫預測出miR-15a-5p是lncRNA MEG3的潛在靶標，因此筆者預測lncRNA MEG3可能通過miR-15a-5p參與慢阻肺的發展。本研究發現miR-15a-5p在慢阻肺患者中明顯的降低，且急性加重組中miR-15a-5p降低更為顯著。并且慢阻肺患者中miR-15a-5p的表達水平與lncRNA MEG3呈顯著負相關。這與Ezzie[12]的研究中miR-15b-5p在肺泡灌洗液中表達水平升高不同，其原因可能由于檢測的樣本不同，有學者報道同一患者的血漿和支氣管肺泡細胞學之間的miRNA 沒有明顯的關系[25]，并且尚未有人研究過慢阻肺患者肺組織或外周血中miR-15a-5p的表達水平，故無從得知miR-15a-5p在慢阻肺患者中的表達是否與miR-15b-5p一致。但Yuan等發現miR-15a-5p抑制劑可恢復細胞侵襲、凋亡的作用[26]，本研究經過多因素Logistic回歸分析發現miR-15a-5p是慢阻肺發生的唯一保護性因素(OR0.029，P=0.002)與此研究相符，故筆者推測慢阻肺患者miR-15a-5p的低表達可能緩解炎癥因子及細胞凋亡。通過ROC曲線分析發現lncRNA MEG3及miR-15a-5p都對慢阻肺具有一定的診斷價值AUC分別為0.661、0.66。靈敏度及特異度分別為76.92%、50%及60%、77.27%。lncRNA MEG3的靈敏度高但特異性較低，而miR-15a-5p的特異性高但靈敏度較低，兩者相結合對慢阻肺有較好的診斷介質，AUC為0.721靈敏度及特異度分別為81.82%及55%。

我們的研究中未發現慢阻肺患者lncRNA MEG3及miR-15a-5p的表達水平并與是否吸煙以及肺功能指標等有明顯相關性，可能是因為慢阻肺中lncRNA-micro RNA基因調控網絡復雜，對人體內生物學行為的調控受多種因素的影響。并且我們收集的標本數目有限，并且臨床指標的個體差異性較大，受影響因素較多，因此其與各臨床指標的關系需進一步研究。

本研究存在一定的局限性，未來我們將通過細胞模型，基因敲除或過表達及雙熒光素酶實驗明確慢阻肺患者lncRNA MEG3與miR-15a-5p的具體傳導通路。總之，慢阻肺患者外周血中lncRNA MEG3表達水平升高，miR-15a-5p表達水平明顯下降并且與疾病嚴重程度相關，lncRNA MEG3聯合miR-15a-5p對慢阻肺有較好的診斷價值，我們推測LncRNA MEG3通過負向調節miR-15a-5p介導慢性阻塞性肺疾病的進展。