空心泡組織培養及快速繁殖

楊鼎元 陳哲 官紀元 沈璽龍 李永霞 張群英

摘 要：以空心泡（Rubus resaefolius）帶腋芽莖段為外植體，建立快繁體系，篩選出最佳外植體并滅菌處理，探尋6-BA、IBA、NAA3種生長調節劑對空心泡不定芽的誘導情況。以3種調節劑的單因素試驗為基礎，設計正交試驗，篩選最佳的繼代培養生長調節劑組合。結果表明：以75%酒精滅菌30S結合0.1%升汞處理7min的外植體成活率最高，為80.78%;污染率為15.44%。6-BA濃度為0.6mg·L-1時，增殖系數最高，為8.07;IBA濃度為0.02mg·L-1時，增殖系數最高，為7.03;NAA濃度為0.02mg·L-1時，增殖系數最高，為6.87。3種生長調節劑聯合使用時，在6-BA濃度為0.6mg·L-1、IBA濃度為0.06mg·L-1、NAA濃度為0.02mg·L-1時獲得空心泡外植體的增殖系數最高。

關鍵詞：空心泡;組織培養;不定芽;生長調節劑;正交實驗法

中圖分類號 S663.2 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）05-0059-04

Abstract： With a Rubus resaefolius in the process of subculture， the best explants were selected for sterilization treatment， 6-BA， IBA and NAA for induction of adventitious buds of Rubus resaefolius. Based on the single factor experiment of three regulators， orthogonal experiment was designed to select the best combination of subculture culture growth regulators. The results showed that the survival rate of explants treated with 75% alcohol for 30s and 0.1% HgCl2 for 7 minutes， while the highest proliferation coefficient was 8.07 when the concentration of 6-BA was 0.6mg·L-1， and the highest growth coefficient was 7.03 when the concentration of IBA was 0.02mg·L-1， and the highest increase coefficient was 6.87 when the concentration of NAA was 0.02mg·L-1; When the three growth regulators were used together， the highest proliferation coefficient was obtained when the concentration of 6-BA was 0.6 mg · L-1， IBA was 0.06 mg·L-1 and NAA was 0.02mg·L-1.

Key words： Rubus resaefolius; Tissue culture; Adventitious bud; Growth regulator; Orthogonal experiment

懸鉤子屬植物成熟果實多漿，味酸甜，在歐美有長期栽培食用的歷史[1-2]。近年來，懸鉤子屬的紅樹莓（Rubus idaeus L.）、黑樹莓（Rubus mesogaeus）作為優質水果被大量引入中國，產生了較高的社會經濟價值[3-4]。與國外對比，我國豐富的野生懸鉤子資源尚未得到充分的開發利用[1]。空心泡（Rubus resaefolius）果實外形飽滿，風味極佳，除鮮食外，也可加工成果汁、果酒、蜜餞等，是一種優良的野生果樹資源。但由于其自然狀態下產量較低、分布較散，近年來有種植者嘗試規模化開發利用，但優質種苗和配套技術存在問題[5]。為此，本試驗通過建立空心泡組培快繁體系，優化生長調節劑的使用，增加繁殖系數，以達到快速育苗和降低育苗成本的目的，旨在為野生懸鉤子植物空心泡的快速高效繁育和實現工廠育苗提供可靠的技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料 外植體選用貴州省植物園懸鉤子育苗圃內無病蟲害空心泡長勢一致的枝條。去除葉片、葉柄留下中部莖段，以洗滌劑浸泡20min，在流水下刷去泥沙附著物，并沖洗10min，將清洗后的枝條剪成帶腋芽1～2cm的長莖段。

1.2 試驗方法[6-11] 培養環境：培養室溫度（25±2）℃、濕度（60±5）%，光周期14h·d-1，調節電流、光源與植株距離，使光強保持一致（1500lx）。培養基：采用MS培養基，蔗糖濃度30%，瓊脂7.5%，pH值為5.8。生長調節劑：初代培養不添加植物生長調節劑;采用預實驗中效果較佳的6-BA（芐氨基腺嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）。

1.2.1 外植體的滅菌處理 外植體滅菌劑的選擇、滅菌時間的把控對外植體的污染率、成活率具有直接影響。試驗選擇75%酒精（10s、20s、30s）和0.1%升汞（4min、7min、10min）組合處理，滅菌處理完畢的外植體接入培養瓶內，每瓶1株，每處理10瓶，重復3次，21d后調查接種污染率、存活率。計算公式如下：

污染率=（污染的外植體數/接種的外植體數）×100;

成活率=（萌動的外植體數/接種的外植體數）×100

1.2.2 生長調節劑單因素試驗 為探究不同濃度生長調節劑對不定芽增殖的影響，以MS為培養基，將6-BA、IBA、NAA設置5種濃度：6-BA（0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1）、IBA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1、0.10mg·L-1）、NAA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1、0.10mg·L-1）。每個處理10頭不定芽，3次重復，30d后統計增殖系數。計算公式如下：

增殖系數=不定芽總數/接種的不定芽數

1.2.3 增殖培養正交試驗 以初代培養的不定芽為試驗材料，進行繼代培養，設計3因素3水平L9（33）正交表進行試驗設計，在懸鉤子屬植物最常用的激素中挑選6-BA、IBA、NAA設計3因素3水平的正交試驗，觀察記錄生長系數，每個處理10個不定芽，3次重復，30d后計算增殖系數。因素水平：6-BA（0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、1.0mg·L-1），IBA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.1mg·L-1），NAA（0.02mg·L-1、0.04mg·L-1、0.1mg·L-1）。

1.3 數據處理 數據采用Excel表格統計，SPSS26.0進行分析比較。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑對外植體的影響 由表1可知，滅菌劑的滅菌時間對外植體的污染率和成活率有著顯著影響。隨著滅菌時間的增加，外植體的污染率不斷降低。在酒精消毒時間不變的條件下，10s和20s酒精滅菌時間的影響下，隨著升汞滅菌時間的延長，污染率水平呈現出差異顯著性，僅在30s酒精消毒條件下外植體污染率無差異顯著性。說明利用0.1%升汞滅菌時，時間對滅菌效果有一定的影響力，在升汞消毒時間不變的條件下，通過改變酒精的滅菌時間也可以得到類似結果。說明單一滅菌劑難以獲得理想的滅菌效果，聯合施用的滅菌效果更為理想。隨著滅菌時間的延長，外植體成活率呈現出快速增加，但在高滅菌時間處理中，會出現部分死亡的植株，這是因為過長的滅菌處理損傷了外植體生長點產生毒害，導致外植體死亡。本次試驗材料最佳的滅菌處理是30s酒精和7min升汞處理，能達到較低的污染率和最高的成活率。

2.2 不同生長調節劑對不定芽的影響

2.2.1 6-BA濃度 6-BA是最常用的細胞分裂素，可促進細胞和芽的生長、芽的分化。由圖1可知，增殖系數隨著6-BA濃度的升高呈現出先增加后減少的趨勢，且與0.2mg·L-1時差異顯著。在濃度為0.6mg·L-1時，增殖系數最大為8.07。

2.2.2 IBA濃度 IBA能促進細胞分裂與細胞生長。由圖2可知，在濃度為0.02mg·L-1時增殖系數最大，在濃度為0.04mg·L-1、0.06mg·L-1、0.08mg·L-1時增殖系數差異不顯著，但濃度為0.1mg·L-1時與增殖系數最低，且與其他濃度差異顯著。增殖系數隨著IBA濃度的升高呈現出減少的趨勢，表明低濃度時IBA能促進外植體不定芽的增殖，高濃度表現為抑制。

2.2.3 NAA濃度 NAA能促進細胞分裂與細胞生長以及芽的分化。由圖3可知，NAA濃度為0.02mg·L-1時增殖系數最大為6.87，NAA濃度為0.04mg·L-1、NAA濃度為0.06mg·L-1、NAA濃度為0.08mg·L-1時增殖系數分別為5.97、5.8、5.23，且差異不顯著;NAA濃度為0.1mg·L-1時增殖系數最低為4.63，且與其他試驗濃度存在差異顯著。增殖系數隨著NAA濃度的升高呈現出先增加后減傷的趨勢，這表明低濃度的NAA能促進外植體不定芽的增殖，而高濃度表現為抑制。

2.3 篩選最佳生長調節劑配方 由表2可知，培養基處理6（6-BA濃度0.6mg·L-1、IBA0.02mg·L-1、NAA0.02mg·L-1）平均增殖系數為9.70，植株長勢健壯，生長較快，葉片翠綠，為本試驗下最佳生長調節處理組合。在3個水平的生長調節劑處理下，K2值最大，K3值其次，K1值最小，表明在不同水平的處理下，中水平處理下的因素對外植體增值系的數影響更大;通過對極差R值大小的比較，本試驗采用的3種植物生長調節劑對外植體增殖系數的影響如下：6-BA（11.76mg·L-1）>NAA（4.55mg·L-1）>IBA（4.36mg·L-1），且6-BA的R值遠大于NAA和IBA的R值。表明在3種激素的聯合使用中，6-BA濃度的影響遠大于其他2種生長調節劑，NAA濃度的影響大于IBA濃度的影響;通過對比K1值、K2值、K3值，發現K1值與K2值、K3值呈現一定的相關，表明3種生長調節劑對空心泡的不定芽增殖存在一定的聯合作用。

3 結論與討論

植物生長調節劑是植物組織培養的關鍵因子之一[9]，通常不同的植物生長調節劑對不同植物外植體具有不同的誘導效果。本試驗選用前期預試驗中不定芽高于對照組的6-BA、IBA、NAA3種植物生長調節劑進行處理，結果表明，6-BA對空心泡繼代培養不定芽的增殖作用較為顯著，當三者聯用，在6-BA濃度0.6mg·L-1、IBA0.02mg·L-1、NAA0.02mg·L-1時，有著最大的不定芽增殖系數，為空心泡最佳的繼代培養生長調節劑配方。

對外植體進行滅菌處理是建立組織培養體系的重要環節。針對空心泡，本實驗篩選出75%酒精滅菌30s結合0.1%升汞處理7min的方法最佳。結合文光琴等[9]的研究結果，初代培養基不添加任何植物生長調節劑的MS培養基，可避免生長調節劑的積累疊加。在后續培養中，可以通過調節光照強度、降低環境溫度等方法降低組培苗的玻璃化現象。外植體接種之后7d，可用暗培養/弱光培養可改善外植體褐化的問題。

參考文獻

[1]李維林，賀善安，顧姻.中國懸鉤子屬植物的利用價值概述[J].武漢植物學研究，2000，18（3）：237-243，246.

[2]孫長清，邵小明，王黎明，等.懸鉤子屬植物的開發利用概述[J].廣西植物，2004（6）：572-582.

[3]張群英，文光琴，李永霞，等.優良樹莓品種及當地野生樹莓的引種比較研究[J].種子，2015（1）：100-103.

[4]Jeong H S，Hong S J，Cho J Y，et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension： Randomized，double-blinded，placebo-controlled clinical trial[J].Nutrition，2016，32（4）：461-467.

[5]夏武峰，唐海東，鐘必鳳，等.11個國外樹莓品種在四川雅安的引種試驗[J].中國南方果樹，2010（1）：79-81.

[6]楊鼎元，張群英，陳哲，等.懸鉤子屬植物的組培快繁技術研究進展[J].現代園藝，2019（11）：16-18.

（上接61頁）

[7]劉寬博，王明力，萬良鈺，等.樹莓中主要活性成分及產品研究進展[J].中國南方果樹，2016（6）：178-183.

[8]王禹.應用正交試驗建立樹莓組織培養快繁體系[J].黑龍江農業科學，2021（01）：73-78，87.

[9]楊帆，張萬博，朗賢波，等.植物生長調節劑對樹莓組培苗增殖生長的影響[J].延邊大學農學學報，2014（1）：12-15.

[10]霍朗寧，張東升，賈忠奎.樹莓‘沙尼’組培技術[J].東北林業大學學報，2015（3）：6-9.

[11]姚思揚.‘紅顏’草莓組培快繁技術的優化[D].吉林：吉林農業大學，2019.

[12]Poothong S，Reed B M. Optimizing shoot culture media for Rubus germplasm：the effects of [NH+4]，NO3，and total nitrogen[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2016，52（3）：265-275.

[13]文光琴，張群英，廖優江，等.美國黑莓組織培養一次成苗研究[J].種子，2016，35（010）：121-124.