辛溫通陽中藥蔥白提取物對高脂血癥大鼠AMPK/mTOR信號通路的影響＊

馮云霞，張 書，謝沛霖，朱 旭，趙曉雯

（武漢市中西醫結合醫院 武漢 430022）

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是一類代謝紊亂性疾病，其本質是人體內脂質代謝、轉運的紊亂，其臨床特點是患者血漿中膽固醇（Total cholesterol，TC）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平升高，并且是各類心腦血管疾病諸如脂肪肝、動脈粥樣硬化、冠心病等的重要誘發因素[1-2]。近年來，隨著人們生活條件的改變，脂肪攝入與運動消耗比例失衡，使高脂血癥的發病率日益升高，嚴重威脅著人們的健康[3]。

西醫是高血脂癥常用治療方法，但是由于西醫治療產生較大副作用，對生理、心理造成較大創傷，影響治療效果[4]。而在我國，中藥聯合西藥治療效果更顯著，且長期遵醫囑服藥治療效果遠比停止治療效果更明顯[5]。因此，為了更顯著地提高治療高血脂癥的效果，開發中醫藥中對其治療的優勢療法勢在必行。

腺苷5'-單磷酸激活的蛋白激酶/雷帕霉素的哺乳動物靶標（Adenosine 5'-monophosphate -activated protein kinase/ mammalian target of rapamycin，AMPK/mTOR）信號通路在細胞內構成一個合成代謝和分解代謝過程的開關[6-7]，在高血脂、高血糖等引起的氧化應激中被認為會過度激活mTOR通路，隨之可影響胰島素信號通路，導致糖脂代謝紊亂加劇，促進肝損傷的發生[8]。對此，針對AMPK通路進行的治療具有良好的作用，可用于治療代謝性疾病如糖尿病、肥胖、炎癥和癌癥等[9]，研究控制該通路是重要的研究方向。

辛溫通陽中藥蔥白提取物，指的是從蔥科植物細香蔥（Bulbus Allii Fistulosi）成熟莖下端蔥白中提取的一類活性成分，在最近的中醫藥研究指出，具有抗氧化損傷、改善缺血心肌的能量代謝、減少炎癥因子分泌、調節血脂的作用[10-11]。但蔥白提取物對但其治療高血脂的機理暫時不清楚。因此，本課題以大鼠高脂血癥動物模型為研究對象，灌喂蔥白提取物予以治療，初步探討中藥蔥白提取物對高脂血癥大鼠AMPK/mTOR信號通路的影響，為臨床上高脂血癥的治療領域提供理論與實驗基礎。

1 材料

1.1 實驗動物

健康的雄性6周齡SD大鼠48只，每只體重約180-220 g，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0104；于溫度22-26℃，相對濕度50%-60%的飼養條件下進行飼養，人工光照明暗各12 h。本實驗中所有實驗操作人員均具備《實驗動物專業技術考試合格證書》。所有動物實驗均符合動物管理委員會《實驗動物倫理證》的相關規定。

1.2 試劑

蔥白提取物（取自博心通軟膠囊，批準文號：鄂藥制字Z20180167），戊巴比妥鈉（貨號P3761，sigma merck公司）；膽固醇，膽酸鈉，甲基硫氧嘧啶，吐溫-80，丙二醇，辛伐他丁（貨號分別為C104028，S161419，H109550，T104865，P103433，S129538 阿拉丁公司）；豬油（展藝公司）；蔥白提取物（武漢市第一醫院）；TC測試盒，TG測試盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）測 試 盒 ，丙 二 醛（Malondialdehyde，MDA）測 試 盒 ，琥 珀 酸 脫 氫 酶（Succinate dehydrogenase，SDH）測試盒（貨號分別為A111-2-1，A110-2-1，A001-3-2，A003-1-1，A022-1-1，南京建成公司）；伊紅，蘇木素（貨號分別為C0109，C0107，碧云天公司）；飽和油紅“O”染色液，甘油明膠封片劑（貨號分別為G1015，G1402，Servicebio公司）；OCT包埋劑（貨號4583，Sakura公司）；化學發光試劑（貨號為WBKLS0500，millipore公司）；雷帕霉素的哺乳動物靶標（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白一抗，腺苷5'-單磷酸激活的蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate -activated protein kinase，AMPK）蛋白一抗，乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl Coenzyme A Carboxylase，ACC）蛋白一抗，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）蛋白一抗，山羊抗兔IgG（貨號分別為PAB30674，PAB30970，PAB39566，PAB36269，SAB43714，bioswamp公司）。磷酸化mTOR蛋白一抗（p-mTOR），磷酸化AMPK蛋白一抗（p-AMPK），磷酸化ACC蛋白一抗（p-ACC）（貨 號 分 別 為 ab137133，ab133448，ab68191，abcam公司）。

1.3 儀器

全自動生化分析儀（型號BS-420，深圳邁瑞公司）；酶標分析儀（型號AMR-100，杭州奧盛公司）；正置顯微鏡（型號DM1000，徠卡顯微系統有限公司）；石蠟切片機（型號VCM-3558，維克科教公司）；攤片烤片機（型號TK-218V，泰維公司）；生物組織包埋機-冷凍機（型號RD-BM/ML，源達鑫）；生物組織包埋機（型號KD-BM，科迪公司）；自動組織脫水機（型號ZT-12M，亞光病理公司）；全自動化學發光分析儀（型號Tanon-5200，上海天能公司）；電泳儀（型號mini protean 3 cell，美國Bio-Rad）。

2 方法

2.1 大鼠高脂血癥模型構建

設置正常組5只為空白對照，不進行任何處理。另外25只SD大鼠根據毛新民等[12]的方法配制脂肪乳：丙二醇30%、豬油20%、吐溫-80 20%、膽固醇10%、膽酸鈉2%、甲基硫氧嘧啶1%、加水至100%制成脂肪乳，采用脂肪乳灌胃法構建大鼠高脂血癥模型。按照脂肪乳10 mL·kg-1·d-1灌胃，10天即可造成高脂血癥模型。造模10天后，收集大鼠血清進行全自動生化檢測血清內TC及TG含量進行模型鑒定。

2.2 分組干預

除空白對照組外，將構建成功的高脂血癥大鼠模型隨機分為5組，每組5只：模型組、蔥白低劑量組、蔥白中劑量組、蔥白高劑量組、辛伐他丁組。空白對照組與模型組大鼠每天分別灌喂生理鹽水，蔥白低劑量組每天按25 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，蔥白中劑量組每天按50 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，蔥白高劑量組每天按75 mg·kg-1的劑量灌胃蔥白提取物，辛伐他丁組每天按100 mg·kg-1的劑量灌胃辛伐他丁，連續4周灌喂。于給藥第4周末處死動物，大鼠3%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，取血后，戊巴比妥鈉過量麻醉致死（100 mg·kg-1），以動物無呼吸無心跳判斷動物死亡。后觀察記錄肝組織重量，收集各組大鼠的肝臟、血清樣本備用。

2.3 各組大鼠血清脂質含量檢測

于4℃融解待測血清樣本，用深圳邁瑞BS-420型全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、低密度脂蛋白膽固醇（Low-density lipoprotein，LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein，HDL-C）的含量，檢測試劑為深圳邁瑞配套生化試劑盒。

2.4 肝臟組織形態學的觀察

將固定好的肝臟組織切取0.3 cm的厚度，按常規步驟脫水浸蠟包埋。切片厚度取3 μm并進行水浴處理后，將切片小心貼附于載玻片上，再放入展片器展片，貼平粘緊后烤片。根據蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosinstaining，HE）的步驟對組織切片進行染色并通過顯微鏡拍照，再利用Leica Application Suite 圖象系統采集樣本相關部位。

2.5 生化方法檢測各組大鼠肝臟組織中TC、TG、SDH、SOD及MDA含量

根據TC測試盒、TG測試盒、SOD測試盒、MDA測試盒和SDH測試盒的說明書，對大鼠的肝臟組織進行檢測相關指標。

2.6 油紅“O”染色法觀察各組肝臟組織脂質沉積情況

用手術刀將肝臟組織修平整后，用OCT包埋劑包埋切片，取厚度5-8 μm并貼于載玻片上。冰凍切片干燥30 min后，固定洗滌并使用60%異丙醇浸洗。使用油紅“O”染液染色10 min（加蓋避光），洗片后用蘇木素染核3-5 min，最后用甘油明膠封片并通過顯微鏡拍照，使用Leica Application Suite 圖象系統采集樣本相關部位。

2.7 Western blot法檢測各組大鼠肝臟組織中AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的表達

在裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑；將肝臟組織剪成細小的碎片，按比例加入裂解液（每20 mg組織加入200 μL裂解液），于勻漿器中進行徹底勻漿。裂解后的樣品放入離心機中，在4℃下用10000 r·min-1的轉速離心力離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書，測定蛋白質濃度。將各組樣品進行電泳，電轉至硝酸纖維素膜。膜放入5%的脫脂牛奶中，于室溫搖床封閉2 h。分別加入一抗mTOR（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、ACC（1∶1000）、GADPH（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、p-ACC（1∶5000），于 4℃孵育過夜。洗膜3次后，孵育山羊抗兔二抗（1∶10000），室溫1 h。取化學發光液A和B等量混勻，洗膜3次后，將膜放置在暗室中，將發光液充分加在膜的正面。然后將膜放置在全自動化學發光分析儀中，調節掃膜條件進行掃膜，通過TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

2.8 統計學處理

采用SPSS 19.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清脂質含量檢測

造模后進行生化檢測顯示（見表1），模型組與對照組相比，大鼠的血清中TC與TG含量顯著升高（P＜0.05），證明造模成功，可分組干預進行實驗。干預實驗4周后，與空白對照組相比，模型組大鼠血清中TC（6.90±0.24）mmol·L-1、TG（3.29±0.10）mmol·L-1、LDL-C（3.40±0.16）mmol·L-1顯著升高，HDL-C（1.03±0.02）mmol·L-1顯著降低（P＜0.05）；蔥白提取物與辛伐他丁組和與模型組相比，大鼠血清中的TC、TG和LDL-C顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著上升（P＜0.05）。在3個劑量中，蔥白高劑量組的效果最明顯，TC（5.22±0.07）mmol·L-1、TG（1.37±0.02）mmol·L-1和LDL-C（2.13±0.03）mmol·L-1水平都顯著下降，HDL-C（1.71±0.02）mmol·L-1水平（P＜0.05）顯著上升。

表1 各組血清脂質含量比較

圖1 不同分組的肝臟組織HE染色結果

表2 各組肝組織生化檢測結果比較

3.2 肝臟組織HE染色結果

結果如圖1顯示，空白對照組大鼠肝細胞形態正常，細胞內無脂滴分布，肝索排列整齊，肝竇清晰。模型組大鼠肝細胞明顯變大，肝細胞內出現嚴重的脂肪變性，細胞質內有多數大小不一的脂滴，將細胞核擠向一側，肝竇變窄，肝索排列不齊。用藥4周后，與模型組相比，蔥白提取物低、中、高劑量組的大鼠肝細胞內脂肪變性程度逐漸降低，細胞內的脂滴變少變小，特別是蔥白提取物高劑量組得到了明顯改善。

3.3 肝組織生化檢測結果

肝組織生化檢測結果顯示（見表2），干預實驗4周后，與空白對照組相比，模型組大鼠血清中的TC（5.59±0.06）mmol/gprot、TG（2.64±0.03）mmol·gprot-1、MDA（40.40±1.10）mmol·gprot-1水平顯著升高，SOD（15.29±0.56）U·mgprot-1及SDH（29.04±1.67）U·mgprot-1水平顯著降低（P＜0.05）；蔥白提取物組與辛伐他丁組與模型組相比，高血脂癥大鼠血清中的TC、TG及MDA水平下降，SOD與SDH水平升高；在3個劑量組中，蔥白高劑量組的 TC（3.77±0.04）mmol·gprot-1、TG（1.79±0.02）mmol·gprot-1、MDA（20.02±0.13）mmol·gprot-1水平顯著降低（P＜0.05），而SOD（52.32±1.14）U·mgprot-1與SDH（90.78±2.18）U·mgprot-1水平顯著升高（P＜0.05）。

圖2 不同分組的肝細胞組織油紅“O”染色

表3 AMPK/mTOR信號通路蛋白在不同組中的表達變化

圖3 AMPK/mTOR信號通路蛋白在不同組中的表達變化

3.4 油紅“O”染色結果

結果如圖2顯示，空白對照組肝細胞內細胞核被染色劑染為藍色，胞質中未見明顯橘紅色脂滴，肝細胞排列清晰；模型組細胞明顯腫大，胞核藍染偏向一側，胞質中出現大量彌漫性紅染脂滴，相鄰肝細胞脂滴融合，界限模糊。與模型組相比，蔥白低、中、高劑量組胞質內脂滴逐漸減少；與辛伐他丁組相比，蔥白高劑量組胞質內脂滴更少。

3.5 蔥白提取物對高脂血癥大鼠肝臟中AMPK/mTOR信號通路相關蛋白的表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組中mTOR蛋白（0.71±0.02）的磷酸化水平升高，AMPK蛋白（0.27±0.01）與ACC（0.25±0.02）蛋白磷酸化水平降低；與模型組相比，蔥白低、中、高組與辛伐他丁組mTOR蛋白磷酸化水平均下降，AMPK蛋白磷酸化水平升高，且蔥白提取物治療組呈現一定的劑量依賴關系。其中，蔥白高劑量組AMPK蛋白（0.53±0.01）與ACC蛋白（0.53±0.01）磷酸化被促進，而mTOR蛋白（0.62±0.02）磷酸化被抑制（見表3和圖3）。

4 討論

高脂血癥是影響心血管疾病如動脈粥樣硬化和冠心病的關鍵因素[13]，治療高脂血癥可以為預防心血管疾病提供有效的方法。在臨床中，TG、TC、LDL-C和HDL-C是檢測高脂血癥患者的常用指標。本研究中的大鼠高脂血癥模型其血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C顯著降低，且病理組織切片染色結果表明模型組大鼠肝臟細胞發生明顯的脂肪變性，證實本實驗高脂血癥大鼠模型具有可靠性。辛伐他丁作為羥甲基戊二酰輔酶A（Hydroxymethylglutaryl coenzyme A synthase，HMG-COA）還原酶抑制劑，可抑制內源性膽固醇的合成，從而降低血液中的脂質水平達到治療效果[14]，因此在本研究中使用辛伐他丁作為陽性對照。本研究證實蔥白提取物治療組與辛伐他丁均可降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平且升高HDL-C水平，這與馮云霞等[15]采用蔥白提取物治療高脂血癥大鼠的結果一致。

祖國醫學在治療高脂血癥方面具有獨特的優勢，能有效降低血脂水平，防止動脈粥樣硬化，且藥效溫和、不良反應少，受到越來越多患者的青睞[16]。已有文獻報道蔥白提取物具有心臟保護、抗血栓、抗氧化、護肝、抗腫瘤等多種顯著的藥理作用[17]。超氧化物歧化酶（SOD）是機體內能清除超氧陰離子自由基和保護細胞免受損傷的重要抗氧化酶之一，其水平高低可間接反應機體清除氧自由基的能力。丙二醛（MDA）是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化產物，其水平高低可間接反應機體脂質氧化情況。本研究中與模型組相比，蔥白低、中、高處理組與辛伐他丁組均能降低大鼠血清中的MDA水平，升高SOD水平，且根據本研究推測，隨著蔥白提取物濃度的增加，其改善血清各項指標的效果越好。Han等[18]研究發現大果榆樹提取物可通過激活AMPK途徑調節脂質代謝，Cao等[9]在研究青蒿素對小鼠動脈粥樣硬化的保護作用機制中表明青蒿素能通過AMPK/mTOR/ULK1途徑促進巨噬細胞自噬，從而減輕動脈粥樣硬化。這表明在降血脂中藥的開發及其作用機制的研究中，關于藥物在AMPK/mTOR信號通路中的作用機制成為研究藥物機制的重要方向。為進一步探討蔥白提取物發揮降血脂作用的機制，課題組研究了各組大鼠肝臟中的AMPK/mTOR通路蛋白的表達情況，這也是在AMPK/mTOR通路上首次對蔥白提取物的作用機制進行探討。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一種通過激活促進脂肪酸氧化和抑制肝臟脂質堆積的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可通過磷酸化和失活其公認的下游靶標乙酰輔酶A羧化酶（ACC）來調節脂質代謝[19]。在AMPK/mTOR通路中，AMPK的磷酸化通過降低mTOR水平來抑制脂肪形成[20]。Han等[21]在研究紅藻素-6-β-龍膽糖苷的降脂作用時，藥物治療組的AMPK磷酸化水平升高，而mTOR磷酸化水平降低，表明該藥物可通過調節AMPK/mTOR信號通路來調節大鼠的脂質代謝。本研究模型組大鼠的AMPK磷酸化水平較空白對照組有明顯的降低，而mTOR水平則明顯升高，經4周治療后，蔥白提取物能明顯促進AMPK磷酸化，降低mTOR水平，蔥白高劑量組的干預效果與辛伐他丁組的結果相當。類似的，Zhu等[22]表明當AMPK/mTOR通路被抑制時，會減弱藥物干預對肝臟脂肪變性的有利作用。因此，我們推測蔥白提取物可以通過影響AMPK/mTOR信號通路來調節血脂水平，達到降低血脂的效果。綜上所述，蔥白提取物能通過調節AMPK與mTOR蛋白磷酸化水平，從而影響AMPK/mTOR信號通路來促進脂肪酸氧化，調節高脂血癥大鼠血清中的血脂水平，提示蔥白提取物有作為治療高脂血癥藥物的潛力，其作用機制有待后續的深入研究。