熱敏灸對IBS模型大鼠血清及結腸組織中SP、CGRP表達的影響＊

章海鳳，李小清，李琳慧，周志剛，周 旭，龔 安，顏純釧，龔紅斌，曾 婷，付 勇＊＊

（1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 南昌 330004）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome ，IBS）是一種較為常見的功能性胃腸疾病，臨床上患者主要表現(xiàn)為腹部疼痛及排便習慣的改變[1]。目前西醫(yī)治療多采用解痙類藥物、導瀉劑、止瀉劑、益生菌類藥物、抗抑郁類藥物等以針對患者不同癥狀進行治療，然而因藥物治療不能全部根治、易出現(xiàn)便秘、頭痛、惡心、神經(jīng)過敏等藥物毒副作用以及患者可能呈現(xiàn)依賴性等原因導致患者的服藥依從性、自主性欠佳，整體治療效果未達理想效果，故嚴重影響此類患者的正常生活、工作及生存質(zhì)量。此外，因其發(fā)病機制復雜、病情反復難以治愈，對于患者的就醫(yī)成本及社會的醫(yī)療成本均造成一定壓力。故完善此疾病的生理病理基礎、疾病產(chǎn)生機制，找尋有效的治療手段對于IBS患者及現(xiàn)代醫(yī)學來說有重要意義。

現(xiàn)如今雖有眾多學者聚焦于IBS的相關研究，但仍對其發(fā)病機制未有清晰、完整的闡述。其中研究表明IBS與內(nèi)臟高敏感性、胃腸動力紊亂有緊密聯(lián)系[2]。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的深入，眾多研究結果表明IBS患者大腦（中樞神經(jīng)）與胃腸道（腸神經(jīng)系統(tǒng)）兩者之間存在異常互動。在腦-腸相互作用過程中，腦腸肽的表達異常起著重要作用，其表達水平可直接影響內(nèi)臟超敏反應的程度。SP、CGRP均屬于腦腸肽，兩者可共同存在、相互作用以參與傷害性疼痛信息的傳送，從而IBS患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉等癥狀[3]。

熱敏灸作為中醫(yī)療法中的一種安全、有效的治療手段，對于IBS的治療頗有優(yōu)勢。事實上，近年來有多項臨床研究表明熱敏灸可有效治療IBS且相較傳統(tǒng)艾灸效果更甚[4-6]。但目前針對熱敏灸有效治療IBS的機制研究尚未全面，且未發(fā)現(xiàn)從SP、CGRP因子方向探索熱敏灸發(fā)揮治療IBS作用的研究。基于此，本次實驗通過本研究通建立IBS大鼠模型，觀察熱敏灸干預后大鼠血清及組織中SP、CGRP的蛋白表達水平變化，研究其可能機制，以期為其臨床使用提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組情況

30只SD大鼠（雄性，6-8周，190±10 g），SPF級，購自湖南斯萊克景達生物有限公司，按組別分籠飼養(yǎng)，動物房飼養(yǎng)環(huán)境滿足自由進食、自由進水、溫度20℃-25℃、濕度50%-70%、環(huán)境安靜、晝夜交替（光照周期12 h/12 h）。許可證號：SCXK（湘）2011-0003。本次實驗全程于江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行，已通過江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批（審批號：JZLLSC20220491）。

1.2 實驗藥物與試劑

熱敏灸艾條（江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，6 mm×120 mm，二級精艾絨）；SP（Substance P）ELISA Kit（Elabscience、E-EL-0067c、96T）；Rat CGRP1（Calcitonin Gene Related Peptide 1）ELISA Ki（tElabscience、E-ELR0135c、96T）；包埋石蠟（69019361，國藥集團），無水乙醇（10009218，國藥集團），二甲苯（10023418，國藥集團），兔多抗 SP（DF7522，affinity）；兔多抗 CGRP（DF7386，affinity），中性樹膠（10004160，國藥集團）。

1.3 實驗儀器

紅外電子體溫計（華盛昌（CEM））；高速低溫離心機（上海安亭科學儀器廠TGL-16-aR）；切片機（RM2145、德國 Leica公司）、攤片機（HI1210、德國Leica公司）、烤片機（HI1220、德國Leica公司）；GNP-9080隔水式恒溫孵育箱（上海精宏實驗設備有限公司）；CX31生物顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標儀（Thermo）。自制束縛瓶，自制艾灸器等。

1.4 造模方法

采用番瀉葉煎汁灌胃結合慢性不可預見性刺激建立IBS-D模型[7]，造模周期共21天。制備番瀉葉藥液及灌胃方法如下：按照所需造模的大鼠體質(zhì)量計算對應番瀉葉藥液量、番瀉葉生藥量，紗布包裹番瀉葉并將其置于4倍藥量體積的沸水中浸泡0.5 h，過濾殘余藥渣后煎煮藥液至生藥濃度為0.45 g·mL-1葉藥液，4℃冰箱保存。大鼠灌胃量根據(jù)其體質(zhì)量按10 mL·kg-1標準進行，1次/日。慢性不可預見性刺激共5中刺激因子，含24 h禁水、24 h禁食、晝夜顛倒、4℃冰水游泳3 min、束縛制動2 h，造模期間每日隨機安排1種刺激因子，每種至少出現(xiàn)3次，注意同種刺激因子不能連續(xù)出現(xiàn)，以免動物預料刺激發(fā)生。

1.5 干預方法

空白組不予任何刺激，正常條件下飼養(yǎng)；造模組大鼠隨機分為模型組（6只）及艾灸組（18只）。模型組于造模成功后不予任何刺激，艾灸組采用熱敏灸艾條艾灸“命門”穴，每天每次40 min，共14天。期間觀察大鼠尾溫變化，其中尾溫波動＞1℃為熱敏灸組，尾溫波動≤1℃為非熱敏灸組，尾溫于1℃反復波動的大鼠不納入此次實驗觀察。最后熱敏灸組、非熱敏灸組各納入6只符合要求大鼠

1.6 樣本采集

實驗期間，觀察大鼠一般狀況如精神狀態(tài)、體質(zhì)量、糞便等。實驗結束后禁食24 h，選用濃度為1%戊巴比妥鈉、通過腹腔注射的方式麻醉大鼠（當天稱取大鼠體質(zhì)量并記錄，按45 mg·kg-1比例行腹腔注射），待大鼠進入深度麻醉狀態(tài)后后行腹主動脈取血法采集大鼠血液，每只3 mL左右。低溫離心后標記好組別置于-80℃冰箱中保存，同時快速剪取大鼠結腸組織固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi)保存。

1.7 檢測方法

1.7.1 一般情況及造模情況

實驗期間內(nèi)注意觀察各組大鼠一般狀況，如精神狀況、毛發(fā)、糞便、自由活動情況等，觀察造模情況。

1.7.2 ELISA檢測大鼠血清中SP、CGRP表達

取1份血清標本，于冰上融化后低溫離心取其上清液。室溫下打開ELISA試劑盒，嚴格按照說明書上步驟進行操作。

1.7.3 免疫組化法檢測大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

將結腸組織進行脫水、包埋后切片，切片常規(guī)脫蠟、修復抗原后封閉30 min，PBS清洗3次后滴加相應抗體，最后進行染色處理；顯微鏡下觀察各組大鼠結腸組織不同染色反應，其中正常組織呈現(xiàn)藍紫色，陽性反應呈現(xiàn)為不同程度的棕黃色或棕褐色。鏡下不同倍數(shù)隨機采集3個視野，測定其光密度（OD）值。光密度積分（IOD）=陽性面積×OD/總面積，IOD平均值即為其陽性表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)；計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。統(tǒng)計在滿足正態(tài)檢驗的前提下，采用單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù)，采用LSD-t檢驗比較兩兩組間數(shù)據(jù)，以P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及造模情況

在正常條件下飼養(yǎng)期間，所有大鼠精神活躍，精力旺盛，毛發(fā)光澤不易掉，糞便軟硬適中，多呈橢圓形；造模期間大鼠精神活躍度降低，自主活動明顯減少，毛發(fā)枯槁易抓落，糞便時干時稀；經(jīng)干預后，相比模型組，艾灸組情況有所改善，其中熱敏灸組大鼠情況好轉更為明顯。

模型組大鼠除了精神、自主活動、糞便性質(zhì)的改變外，病理形態(tài)學結果提示，相比空白組，該組的組織結構出現(xiàn)一定程度的紊亂，呈現(xiàn)輕度的炎性細胞浸潤狀態(tài)，但無水腫、增生等情況，符合IBS病理形態(tài)學變化（見圖1）。

圖1 結腸黏膜造模前后組織形態(tài)

2.2 大鼠血清中SP、CGRP表達

與空白組相比，模型組及其他治療組中SP、CGRP的表達水平明顯增高（P＜0.01）；經(jīng)干預后，與模型組相比，熱敏灸組、非熱敏灸組中SP、CGRP蛋白表達降低，其中熱敏灸組降低最為明顯（P＜0.01）（見表1，圖2）。

2.3 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

與空白組相比，其他各組中SP、CGRP的表達水平明顯增高（P＜0.01）；經(jīng)干預后，與模型組相比，熱敏灸組、非熱敏灸組中SP、CGRP蛋白表達降低，其中熱敏灸組降低幅度最明顯（P＜0.01）（見表2，圖3，圖4）。

3 討論

IBS在傳統(tǒng)中醫(yī)學中可歸屬于“泄瀉”、“腹痛”等范疇，臨床癥狀主要以腹痛、腹瀉、腹脹等腹部不適為主，或伴有排便習慣的改變。現(xiàn)西醫(yī)治療多使用鎮(zhèn)靜、解痙、止瀉等藥物治療改善患者癥狀，然此種單一藥物治療效果一般，未達患者理想療效。因此尋找有效、便捷、安全的治療IBS的方式是臨床醫(yī)學亟需解決的問題及難點。中醫(yī)在此類疾病治療上具有頗多經(jīng)驗，療法多元，療效顯著。針灸作為中醫(yī)外治法中的一種特色治療手段，在IBS的治療中有著特別優(yōu)勢。有研究證明針灸的治療效果優(yōu)于西藥，且癥狀改善程度更高、復發(fā)率更低[8]。熱敏灸作為一種有效、安全的新型艾灸療法，可通過艾灸敏化腧穴、最大程度激發(fā)人體經(jīng)氣感傳以達到氣至而有效。有臨床研究表明，相比于傳統(tǒng)艾灸，熱敏灸治療效果更佳[4,9]。此外，可在IBS患者體表發(fā)現(xiàn)熱敏高發(fā)穴區(qū)，命門穴即為其中一個，在該穴位進行熱敏灸療法操作，可極大程度提高療效[10]。本課題組前期亦有相關實驗研究表明命門穴可有效用于IBS大鼠的治療[11]，如通過復制IBS模型大鼠，艾灸組（熱敏灸組、非熱敏灸組）于大鼠“命門穴”處行熱敏灸療法，RU-486組予以米非司酮灌胃，采用PCR方法觀察下丘腦組織CRF及腎上腺組織GR的mRNA水平、Western blot檢測下丘腦組織CRH的蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)相比模型組，艾灸組（熱敏灸、非熱敏灸組）IBS大鼠下丘腦組織CRF、CRH的mRNA水平及蛋白表達均降低、RU-486組表達水平升高；腎上腺組織GR的mRNA水平升高，RU-486組表達減少；且兩種組織中熱敏灸組變化最為明顯；該結果說明熱敏灸“命門穴”可通過調(diào)節(jié)CRH、CRH及GR的表達以控制HPA軸，從而有效改善IBS癥狀。付勇等[12]建立IBS大鼠模型，干預組包括熱敏灸組及非熱敏灸組，對照組包括假手術組及NMDA組，實驗過程中觀察大鼠的行為學，實驗結束后測定大鼠內(nèi)臟敏感性、ELISA法檢測血清CORT表達、PCR法檢測海馬組織中GR表達水平；結果表明熱敏灸干預可下調(diào)CORT、上調(diào)GR的表達，改善IBS大鼠內(nèi)臟高敏感性。

表1 ELISA法檢測大鼠血清中SP、CGRP表達（n=6）

圖2 大鼠血清SP、CGRP表達柱狀圖

圖3 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

圖4 大鼠結腸組織中SP、CGRP表達柱狀圖

表2 免疫組化法檢測大鼠結腸組織中SP、CGRP表達

目前，對于IBS的發(fā)病機制研究尚未明確，現(xiàn)代醫(yī)學研究結果表明該疾病發(fā)生與胃腸動力及內(nèi)臟敏感性等因素密切相關[13]。P物質(zhì)（Substance P，SP）存在于十二指腸和結腸，可刺激消化道平滑肌收縮，舒張腸黏膜血管，調(diào)節(jié)胃腸動力和腸道中水、電解質(zhì)的分泌等[14]。此外，SP可傳遞感覺信息，參與內(nèi)臟痛覺感受[15]。因此當患者腸道中的SP分泌異常增加時，消化道平滑肌產(chǎn)生強烈收縮，胃腸道增強運動，從而產(chǎn)生腹痛、腹瀉等癥狀。李榕嬌等[16]根據(jù)患者的疾病分型將80例IBS患者分為腹瀉組（40例）、便秘組（40例），另選擇對照組（40例結腸或胃息肉切除術后患者），觀察各組腸道菌群數(shù)量、檢測各組SP、NPY等血清指標，結果發(fā)現(xiàn)IBS組內(nèi)的SP、NPY含量均升高，提示SP的異常升高與IBS的關聯(lián)性。此外楊梅等[17]的研究表明，溫胃調(diào)腸顆粒可通過降低SP等相關的表達水平從而調(diào)控腦腸軸的平衡，改善IBS腹痛、腹瀉等癥狀。

降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）分布于中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)及消化道中，具有介導痛覺的產(chǎn)生及傳遞、調(diào)節(jié)胃腸道的分泌及運動等功能[18-19]。CGRP可改變內(nèi)臟感覺信號傳導，將疼痛等感覺傳入中樞，導致患者胃腸動力異常及腹部疼痛等癥狀發(fā)生[19-20]。鄧多喜等[21]以合募配穴為原則對IBS大鼠行針刺治療，藥物組灌胃匹維溴胺溶液，發(fā)現(xiàn)針刺組可顯著下調(diào)IBS結腸組織中SP、CGRP等因子的表達以降低腸道高敏感性，減輕腹痛等癥狀；楊敏等[22]發(fā)現(xiàn)針灸聯(lián)合藥物治療可降低5-HT、CGRP等蛋白含量從而調(diào)節(jié)大鼠腦腸肽含量，減輕IBS相關臨床癥狀。

SP和CGRP兩者之間相互作用，可直接產(chǎn)生傷害性作用，抑制SP的降解，激發(fā)大量炎癥介質(zhì)釋放以發(fā)生炎癥反應、參與內(nèi)臟超敏反應[23-24]。

綜上所述，IBS患者出現(xiàn)腹痛、腹瀉的癥狀，可能與其胃腸動力異常及內(nèi)臟高敏感性有緊密聯(lián)系，而SP、CGRP作為參與此類反應中的神經(jīng)遞質(zhì)，在該過程中有著重要調(diào)節(jié)作用。因此，想要有效治療IBS，可通過調(diào)控SP、CGRP以改善胃腸動力、降低內(nèi)臟高敏感性以達到治療目的。基于此，本次實驗通過建立IBS大鼠模型，從大鼠的精神狀況、自主活動、毛發(fā)、糞便等方面觀察各組大鼠的一般情況，過程中模型組大鼠精神活躍度降低，自主活動明顯減少，毛發(fā)枯槁易抓落，糞便時干時稀，而經(jīng)熱敏灸干預后IBS大鼠一般情況有所好轉，且相比非熱敏灸組，熱敏灸組大鼠情況好轉更為明顯。除此之外，本次實驗采集大鼠血清、結腸組織，分別通過ELISA、免疫組化法檢測其血清、結腸組織中SP、CGRP的表達變化。實驗結果表明，與模型組相比，熱敏灸組及非熱敏灸組血清、結腸組織中SP、CGRP的表達均降低；與非熱敏灸組相比，熱敏灸組降低幅度更為明顯。該結果再次證明相比傳統(tǒng)艾灸，熱敏灸治療IBS效果更佳，且可能是通過調(diào)控SP、CGRP的表達以發(fā)揮治療作用。