基于HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號軸探討黃芪補腎活血湯治療乳腺癌骨轉移的作用機制＊

張夢棣，時光喜，浦冬青，馮丹丹，李靜蔚

（1.山東中醫藥大學中醫學院 濟南 250000；2.山東中醫藥大學第一臨床學院 濟南 250000；3.山東中醫藥大學附屬醫院 濟南 250000）

26%-50%乳腺癌患者的首發轉移為骨轉移，乳腺癌骨轉移患者比例高達73%[1]。骨轉移不僅會導致劇烈的骨痛，還會引起病理性骨折、高鈣血癥以及脊髓壓迫等骨相關事件[2]，嚴重影響患者生活質量、預后及總生存期。乳腺癌患者確診骨轉移后的5年生存率僅20%-30%[3]，不同亞型乳腺癌的預后及轉歸也有很大差異，其中以激素受體陽性者最容易發生骨轉移，發生率為63.7%，其晚期乳腺癌患者中72.1%首次轉移的部位為骨[3]。內分泌治療方案中的芳香化酶抑制劑和卵巢功能抑制劑可以抑制雌激素的產生、氟維司群可下調并降解ER、提高破骨細胞活性、抑制成骨細胞功能、促進腫瘤骨轉移。同時乳腺癌骨轉移易對治療產生抗性，疾病易進一步進展，晚期轉移很難治愈，此時主要治療目標是減輕病痛、改善生活質量和延長生存期[4]。

西醫的各種治療手段療效明顯，但伴有一定的副作用，如貧血、胃腸道反應以及食欲下降等。臨床研究中越來越多的中藥方[5-7]被挖掘出具有治療乳腺癌骨轉移作用，同時可以抗癌止痛、減少副作用、提高身體機能狀態及生存質量。本研究在中醫理論指導下，總結臨床病例，提出在經典方劑補腎活血湯基礎上增加補益正氣之黃芪用于乳腺癌骨轉移治療，從“補腎益氣”、“活血化瘀”論治，標本兼治。通過體外實驗探究黃芪補腎活血湯治療乳腺癌骨轉移的作用機制，為乳腺癌骨轉移提供更多的方藥選擇。

1 材料

1.1 細胞來源

乳腺癌細胞MCF-7、成骨細胞MC3T3-E1購于武漢塞維爾公司。

1.2 藥物與試劑

黃芪補腎活血湯中藥飲片由山東中醫藥大學附屬醫院中藥房采購并經過藥學部主任馬傳江鑒定，均符合相應要求。黃芪補腎活血湯制備：黃芪補腎活血湯的組成為：黃芪（Astragali Radix，12 g，產地內蒙古自治區，批號2102230252），熟地（Rehmannia glutinosa，12 g，產地河南，批號 2007280222），補骨脂（Psoralea corylifolia Linn，12 g，產地云南，批號1909030952），菟絲子（ Cuscuta chinensis Lam，12 g，產地內蒙古自治區，批號2012300342），杜仲（Eucommia ulmoides Oliver，4 g，產地湖北，批號2012060152），枸杞（Lycium chinense，4 g，產地寧夏回族自治區，批號201201檢4），當歸（Angelicae Sinensis Radix，4 g，產地甘肅，批號200901檢H），山萸肉（Cornus officinalis Sieb. et Zucc，4 g，產地浙江，批號2012150122），肉蓯蓉（Cistanches Herba，4 g，產地新疆維吾爾自治區，批號2011080252），獨活（Angelicae Pubescentis Radix，4g，產地湖北，2103070122），紅花（Carthamus tinctorius L，2 g，產地新疆維吾爾自治區，批號2103280012）。制藥后于冰箱中保存（4℃）。具體步驟如下：把煎藥器藥缸和蒸發濃縮設備用蒸餾水和75%酒精反復沖洗，將補腎活血中藥用煎藥器加水煎至生藥濃度為1.0 g·mL-1的水劑制成黃芪補腎活血湯藥母液，將濃縮好的湯液離心（3000 r·min-1，半徑16 cm）5 min 5次，濾紙過濾后采用高壓蒸氣滅菌法滅菌后使用0.22 μm無菌濾器過濾。取濾液備用。我們將水煎液的過程進行了嚴格的程序化，以保證水煎液細胞實驗的可靠性和可重復性。經過3次測試，結果均一致。

胎牛血清（Biological Industries公司，貨號04-001-1A)，DMEM高糖培養基（中科邁晨科技有限公司，貨號CM15019），胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號1798320），青-鏈霉素（中科邁晨科技有限公司，貨號cc004），細胞增殖與活性檢測（CCK-8）試劑盒（日本北仁，貨號CK04），EdU-555細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號C0075L），Annexin VFITC/PI Apoptosis Detection Kit（Vazyme，貨 號 A211-02），缺氧誘導因子1α抗體（HIF1α）、內參β-肌動蛋白（β-actin）、羊抗鼠疫球蛋白（Ig）G二抗、山羊抗兔（Ig）G二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號分別為20960-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）；Smad1、Smad5、Runx2、Osterix抗體（英國Abcam公司，貨號分別為ab33902、ab40771、ab192256、ab209484），BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠、SDSPAGE電泳液、一抗稀釋液、二抗稀釋液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為P0010、P0012AC、p0562、P0023A、p0023D），電轉液（北京索萊寶科技有限公司，貨號P0021b）。

1.3 設備

Multiskan Go1510型酶標儀、5424R型低速離心機（美國Thermo Fisher），DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海比朗），LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠），SIM-F124型制冰機（日本SANYO），CascadaⅠ型純化水系統（美國 PALL），Axiovert 40型倒置顯微鏡（德國Carl zeiss）。

2 方法

2.1 細胞培養

將MCF-7細胞、MC3T3-E1細胞置于高糖DMEM完全培養基中培養（含胎牛血清10%，青霉素-鏈霉素1%），37℃，5% CO2條件培養箱中孵育，隔日傳代1次。

2.2 共培養

采用Transwell培養板（美國康寧）構建共培養體系，小室上室中鋪4×104個MCF-7細胞，下室中鋪4×106個MC3T3-E1細胞；Transwell小室中細胞培養24 h之后，向上室中的MCF-7細胞添加藥物，濃度分別0、20、40 mg·mL-1，培養48 h后，收取下室細胞，用于蛋白檢測。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期的MCF-7細胞，胰蛋白酶消化，完全培養基終止消化。制作濃度為每毫升7×104個的單細胞懸液，加入96孔板中（每孔100 μL）。24 h后實驗組加入黃芪補腎活血湯梯度質量濃度（0、20、40、60、120、240 mg·mL-1），對照組加入唑來膦酸梯度質量濃度（0、10、20、40、60 mg·mL-1）。實驗藥物濃度每個濃度設5個平行孔，培養48 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37℃恒溫培養40 min，酶標儀探測450 nm波長處吸光度A。細胞增殖存活率通過GraphPad軟件計算。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將細胞接種于6孔板，繼續培養至細胞融合度約90%時，使用200 μL槍頭于細胞板上劃痕，PBS沖洗清除被劃下的貼壁細胞，然后加入無血清培養基繼續培養。分別于劃痕后0 h、24 h時取樣并拍照記錄。最后使用Image J軟件測量劃痕面積，并計算細胞遷移率。

2.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

取750 μL完全培養基加入24孔板中，取適量細胞鋪入上室，滴加無血清培養基補全至200 μL。將上層小室中的培養基棄掉，并用PBS清洗，在新的孔中添加750 μL多聚甲醛，將上層小室轉移至多聚甲醛固定20 min。固定結束后，將小室取出，用PBS清洗，用棉簽將內膜細胞輕輕旋轉擦拭，在新的孔中添加750 μL 10%結晶紫染色液，將上層小室轉移至其中染色20 min。取出小室，用PBS清洗，顯微鏡拍照。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

離心收集MCF-7細胞加入PBS重懸清洗細胞，然后先后加入FITC Annexin V及PI進行染色，避光孵育15 min后，使用流式細胞儀進行檢測。

2.7 平板克隆實驗檢測細胞克隆增殖能力

將細胞接種于培養皿，置于恒溫細胞培養箱內常規培養1-3周。有集落生成時，終止培養。使用PBS洗滌細胞2次后，分別以4%甲醇、10%結晶紫對細胞進行固定與染色，作用時間均為20 min。PBS清洗，待干燥后在顯微鏡低倍鏡下觀察拍照并計數。其中，將超過10個細胞的集落作為一個有效克隆，以克隆數與接種細胞數的百分比表示各組細胞的克隆形成率。

2.8 Edu增殖實驗檢測細胞增殖能力

將細胞接種于6孔板培養24 h，棄去原培養基，加入500 μL 2x的EdU工作液繼續孵育2 h。EdU標記細胞完成后，進行細胞涂片，加入4%的多聚甲醛，室溫固定15 min。沖洗后，每孔用通透液室溫孵育15 min，再次沖洗后加入Click反應液均勻覆蓋樣品，室溫避光孵育30 min。沖洗后吸除，每孔加11×Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育10 min。吸除后洗滌，然后進行熒光拍照檢測。

2.9 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細胞蛋白表達情況

細胞加藥分組處理48 h，取沉淀，各加含1%PMSF的裂解液約80-100 μL，取上清。BCA試劑盒測蛋白濃度。電泳，每個泳道上樣30 μg；轉膜，然后5%脫 脂 奶 粉 室 溫 封 閉 1 h。 HIF1α、Smad1、Smad5、Runx2、Osterix抗體在4℃下過夜孵育。二抗室溫孵育1 h，顯影。相對蛋白表達量=灰度值（目的）/灰度值（內參）。

2.10 統計學分析

所有實驗均重復3次，采用SPSS 26及GraphPad Prism 9軟件進行統計學分析及作圖，多組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪補腎活血湯抑制MCF-7細胞活力

細胞系選取最容易發生骨轉移的Luminal A型乳腺癌細胞MCF-7，在干預48 h時，CCK-8法檢測顯示在20-120 mg·mL-1黃芪補腎活血湯的干預下相對于空白組具有明顯抑制作用，特別是40-120 mg·mL-1劑量的藥物對MCF-7細胞抑制作用最明顯，得半數抑制濃度（IC50）為（28.58±1.79）mg·mL-1。唑來膦酸組顯示藥物濃度在10-40 mg·mL-1時相對于空白組抑制明顯。見圖1。

3.2 黃芪補腎活血湯有效抑制MCF-7遷移

遷移實驗顯示，黃芪補腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組 細 胞 遷 移 率 分 別 為（22.2±4.1）% 、（17.3±3.4）%，與control組（30.0±7.9）%相比，遷移率明顯降低（P＜0.05），差異具有統計學意義。見表1和圖2。

3.3 黃芪補腎活血湯顯著抑制MCF-7細胞侵襲

Transwell檢測結果顯示，黃芪補腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組穿膜細胞數分別為 414.7±34.0、374.7±58.6，與control組（514.7±24.11）相比，明顯減少（P＜0.05），差異具有統計學意義。見表1和圖3。

3.4 黃芪補腎活血湯明顯促進MCF-7細胞凋亡

圖1 CCK-8 法檢測不同質量濃度黃芪補腎活血湯、唑來膦酸干預MCF-7細胞48 h后的活力變化

圖2 遷移實驗檢測不同質量濃度黃芪補腎活血湯干預MCF-7細胞24 h后的遷移變化

圖3 Transwell檢測不同質量濃度黃芪補腎活血湯干預MCF-7細胞的侵襲變化

流式細胞術檢測結果顯示，黃芪補腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組細胞凋亡率分別為（6.3±0.1）%、（6.2±0.1），較 control組（3.8±0.2）%明顯升高（P＜0.05），差異具有統計學意義。見表1和圖4。

3.5 黃芪補腎活血湯有效抑制MCF-7細胞克隆增殖能力

平板克隆實驗檢測MCF-7細胞黃芪補腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組的細胞克隆個數分別為392.0±51.1、325.3±50.3，與control組（437.3±31.1）相比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖5。

表1 不同質量濃度黃芪補腎活血湯對MCF-7細胞遷移、凋亡、侵襲、克隆的影響

3.6 黃芪補腎活血湯明顯降低EDU細胞陽性率

EDU增殖實驗檢測黃芪補腎活血湯對MCF-7細胞增殖的影響，control組、黃芪補腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組的 EDU 細胞陽性率分別為（22.4±1.5）%、（21.9±1.6）%、（20.2±0.6）%，3 組相比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖6。

3.7 黃芪補腎活血湯抑制HIF1α、Osterix的蛋白表達，提高Smad1、Smad5、Runx2的蛋白表達

乳腺癌細胞選取最容易發生骨轉移的Luminal A型乳腺癌細胞MCF-7，骨細胞選取成骨細胞MC3T3-E1，共培養后收取蛋白。根據IC50，分別選取低、高質量濃度20、40 mg·mL-1用于Western blot中檢測黃芪補腎活血湯對HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5和Runx2蛋白表達的影響，見圖6。結果提示與空白組相比，20 mg·mL-1組和40 mg·mL-1組HIF1α、Osterix的表達均明顯降低（P＜0.05），Smad1、Smad5、Runx2的表達明顯升高（P＜0.05），且 40 mg·mL-1組作用更明顯。見表 2和圖7。

圖4 流式凋亡術檢測不同質量濃度黃芪補腎活血湯干預MCF-7細胞的凋亡變化

圖5 平板克隆實驗檢測不同質量濃度黃芪補腎活血湯干預MCF-7細胞克隆的變化

圖6 EDU增殖實驗檢測不同質量濃度有效黃芪補腎活血湯抑制MCF-7細胞增殖

表2 黃芪補腎活血湯對HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達的影響（）

表2 黃芪補腎活血湯對HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達的影響（）

注：與control組比較，1）P=0.05，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

Smad5 0.90±0.11 1.53±0.143）1.56±0.123）組別Control黃芪補腎活血湯組 20 mg·mL-1 40 mg·mL-1蛋白相對表達量HIF1α 1.07±0.02 0.84±0.042）0.60±0.133）Osterix 1.16±0.13 0.68±0.121）0.61±0.153）Runx2 0.71±0.12 1.06±0.023）1.66±0.143）Smad1 0.44±0.006 0.84±0.083）1.01±0.023）

圖7 Western blot檢測低、高濃度黃芪補腎活血湯抑制MCF-7細胞HIF1α、Osterix蛋白表達，促進smad1、smad5、Runx2蛋白表達

4 討論與結論

乳腺癌骨轉移是一個多種因子參與、多步驟和連續性的級聯反應過程[8]，分為局部浸潤、進入脈管系統、在脈管系統中存活、到達轉移組織或器官、逸出循環系統、形成轉移灶和形成克隆轉移灶等過程[9]。轉移至骨骼的乳腺癌細胞會通過干擾破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成而打破正常骨骼重塑的平衡[10]。目前主要從抑制骨轉移灶中腫瘤細胞的生長和抑制破骨細胞的活性兩方面來減少骨相關事件的發生，常用藥物有雙膦酸鹽、地諾單抗等[9]，但遠期療效仍不理想，且伴有嚴重的副作用。祖國醫學認為“腎損”是乳腺癌骨轉移的主要病因，癌癥日久，復經手術、放化療等，損傷正氣，耗竭腎精，腎主骨生髓，腎精虧虛則骨空髓枯，邪氣乘虛而入，凝結于骨，阻滯經絡，引起疼痛[11-12]。治療上強調整體觀念，根據各個患者不同的臨床癥狀，調整機體陰陽、氣血、臟腑功能的平衡，標本兼治，扶正祛邪，從而減少腫瘤的復發與轉移以及延長生存期與提高生活質量。

近年來，中醫藥治療乳腺癌骨轉移在作用機制探索、臨床療效觀察上的研究均取得了重要進展[13]。馮丹丹等[2]研究證明小金丸通過HIF、VEGF等相關信號通路作用于AR、MMP-9等主要靶點蛋白，改善腫瘤微環境缺氧，抑制血管生成，降低細胞侵襲性和細胞活力。賴琦等[14]通過網絡藥理學發現白術附子湯中的核心藥對“白術-附子”通過AKT1、IL6、MAPK3等核心靶點及雌激素信號通路、破骨細胞分化通路、HIF-1信號通路等治療乳腺癌骨轉移。楊爭等[15]基于循證醫學對比發現，傳統中藥聯合唑來膦酸在改善乳腺癌骨轉移病灶、緩解疼痛、提高生活質量、減少不良反應方面優于單用唑來膦酸的效果。目前對乳腺癌骨轉移的研究主要是抑制乳腺癌細胞轉移、緩解骨轉移引起的骨相關事件，較少的目光集中在骨轉移形成后新骨形成和骨骼重塑[16]。本研究主要探究體外實驗探究黃芪補腎活血湯通過HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號軸抑制乳腺癌骨轉移、促進骨骼重塑的作用機制。

4.1 黃芪補腎活血湯通過抑制HIF1α的表達進而抑制乳腺癌的轉移

腫瘤內缺氧是轉移性癌癥的常見表現，缺氧誘導因子（HIF）是缺氧的標志，腫瘤內缺氧可導致HIF-1的激活。HIF-1是由HIF1α和HIF-1β兩個亞基組成的異源二聚體，α-亞基是HIF-1的主要活性成分，介導對缺氧的適應性反應。HIF1α與原發性乳腺癌預后不良和化療耐藥性相關，HIF1α過表達會激活血管生成、厭氧糖酵解、侵襲和轉移等一系列過程，導致乳腺癌患者腫瘤轉移和死亡的風險增加[17]。而骨髓是一種缺氧的微環境，富含生長因子和血管，并且很容易被乳腺癌來源的腫瘤細胞定植。骨基質是生長因子的儲存庫，以及成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞和T細胞，都分泌細胞因子和趨化因子。骨髓內的低氧水平誘導HIF1α，不僅對惡性腫瘤的轉移有影響，還對骨骼發育、重塑有深遠的影響[18]。

4.2 黃芪補腎活血湯上調Smad1、Smad5誘導成骨形成

Smad1、Smad5屬于由BMP激活的R-Smads蛋白家族，參與BMP所介導的成骨信號通路[19]。在該信號通路中，Smads及其轉錄因子對成骨誘導至關重要。Smads家族的蛋白質之間相互作用導致轉錄活性復合物的形成，這些復合物具有調節各種發育和生物過程的潛力[20]。在軟骨形成的整個過程中，Smad蛋白在軟骨細胞中普遍表達。軟骨內骨形成中的大多數BMP信號轉導是由典型的Smad1/5通路而不是非典型通路介導的，Smad1、Smad5的缺失導致凝結階段的軟骨形成完全停滯[21]。激活的Smad1/5可以調節目標基因—Runx2[22]。在成骨誘導過程中，Runx2通過直接結合轉錄激活復合物與Smads一起發揮作用[23]。Smad1/5和Runx2的聯合作用已在多種細胞系統中得到廣泛研究。Runx2的羧基末端通過與核基質靶向信號（NMTS）重疊的Smad相互作用域（SMID）與R-Smads相互作用[24]。Smad1/5是Runx2的上游調節因子[25]，與Runx2共同作用可誘導間充質干細胞中成骨細胞特異性基因表達，從而促進成骨細胞分化[26]。目前研究發現Smad1/5在細胞成骨的各個周期都發揮重要作用，比如骨髓間充質細胞的成骨、增殖等，并與下游的Runx2產生協同作用，從而上調其他成骨關鍵基因，達到促進骨髓間充質細胞向成骨細胞分化的目[21]。研究表明，Smads在亞核基因座中的定位由Runx2調節激活，亞核結構域中的Smads與Runx2形成共調節復合物以調節基因轉錄[24]。Smad/Runx2復合物誘導成骨細胞分化[27]，并調節成骨細胞中RANKL的表達[20]。考慮到抑制這種轉錄因子作為調節事件上游的治療策略的潛力，這有助于治療機制復雜的骨轉移。

4.3 黃芪補腎活血湯上調Runx2表達發揮腫瘤抑制作用并促進新骨形成

Runx2是屬于Runx家族的成骨特異性轉錄因子，在骨髓間充質細胞成骨分化過程中表達相對較早，是成骨過程中最具特異性的基因。Runx2的表達往往標志著成骨分化的開始，通過調控成骨基因的轉錄來影響成骨細胞的成熟水平[28]。Runx2促進骨髓間充質細胞成骨分化，促進骨骼發育和促進骨再生，但同時也對骨髓間充質細胞的遷移也有一定的影響。Runx2是一種在成骨中起主要作用的轉錄因子，但也在人類乳腺癌中表達，可以使乳腺癌細胞與骨微環境相互作用[29]。在ER陽性乳腺癌中，Runx2顯示出腫瘤抑制特性，這與其在三陰性乳腺癌中的作用相反[30]。在某些細胞中，已知Runx2在乳腺癌期間會被雌激素抑制，否則會作為抗轉移因子發揮作用[31]。骨轉移細胞釋放骨微環境蛋白并由Runx2控制的骨代謝的典型細胞信號傳導，在缺氧下的骨轉移細胞中可以觀察到Runx2下調[32]。根據以往的研究報道，有許多成骨相關基因在骨再生過程中起關鍵作用，Runx2就是其中之一[33]。Runx2可以促進成骨細胞的增殖和由未連接的間充質細胞組成的凝聚細胞層的骨形成[34]，并通過Wnt和轉錄因子的相互調節發揮多種功能[35]。

4.4 黃芪補腎活血湯下調Osterix表達抑制乳腺癌細胞轉移

Osterix（OSX）是一種鋅指轉錄因子，可以通過增加S100A4基因的表達來促進乳腺癌細胞遷移和腫瘤血管生成，這表明Osterix參與了乳腺癌的發生發展，并可能作為乳腺癌治療的潛在靶點。在轉移級聯反應的早期和晚期通過上調Osterix蛋白來促進乳腺癌的骨轉移。Osterix上調與淋巴結轉移有關，對總生存期有負面影響。通過敲低Osterix下調參與侵襲、血管生成和骨溶解的相關蛋白可以抑制乳腺癌的侵襲和溶骨性轉移[36]。

目前，針對乳腺癌骨轉移的藥物和治療主要集中在抑制乳腺癌細胞的轉移和侵襲，關于骨轉移后的新骨形成和骨骼重塑等方面仍缺乏針對性的有效藥物。本研究通過體外實驗探索經典方加減的黃芪補腎活血湯基于HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號軸抑制乳腺癌轉移及促進新骨形成、骨骼重塑的潛在機制，論證了補腎活血法治療腎虛血瘀型乳腺癌骨轉移患者的可行性，期望可以為乳腺癌骨轉移治療提供新的治療靶點和思路，未來將通過動物實驗及臨床證據進一步證明黃芪補腎活血湯治療乳腺癌骨轉移的確切療效。