基于數(shù)據(jù)非依賴性采集質(zhì)譜技術(shù)對注射用曲妥珠單抗及其類似藥結(jié)構(gòu)的表征及相似性研究*

李克，李恒，周琴

(1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所藥物制劑質(zhì)量研究與控制重點實驗室，武漢 430075；2.江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033)

抗體藥物發(fā)展歷史僅有三十多年，近5年來開始進入爆發(fā)階段。僅2020年，美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)抗體藥物12個；中國國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市抗體藥物25個，包括國產(chǎn)品種7個，進口品種18個，獲批的國產(chǎn)抗體藥物以生物類似藥為主[1]。類似藥的開發(fā)可極大縮短企業(yè)研發(fā)產(chǎn)品的時間和降低費用，降低相關(guān)藥品價格，使患者受益。與小分子藥物相比，抗體藥物的相對分子質(zhì)量(Mr)大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不均一，開發(fā)難度和技術(shù)要求較高，因此，生物類似藥如何在結(jié)構(gòu)和功能上盡可能與原研藥相似，包括確認(rèn)蛋白質(zhì)藥物一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列、二硫鍵、翻譯后修飾(PTMs)以及不同批次間比較性研究的數(shù)據(jù)等[3-4]，對生物制藥行業(yè)是一個巨大的挑戰(zhàn)。

數(shù)據(jù)非依賴性采集(data-independent acquisition，DIA)技術(shù)是近幾年新出現(xiàn)的蛋白組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)。不同于傳統(tǒng)的需要選擇特定母離子進行碎裂的數(shù)據(jù)依賴采集(data dependent acquisition，DDA)技術(shù)，DIA可采集所有的碎片離子信息，從而具有全景式掃描、數(shù)據(jù)可回溯等優(yōu)勢[3]。得益于數(shù)據(jù)分析和質(zhì)譜采集速度、質(zhì)量精度和分辨率的顯著進步，近幾年來DIA技術(shù)發(fā)展迅速。高質(zhì)量的DIA定量技術(shù)作為蛋白質(zhì)組定量新技術(shù)將會被逐漸推廣并應(yīng)用于抗體藥物結(jié)構(gòu)表征的研究中。筆者在本研究應(yīng)用DIA的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(DIA LC-MS/MS)[5]技術(shù)對注射用曲妥珠單抗(赫賽汀)生物類似藥進行結(jié)構(gòu)表征，并與原研藥進行相似性比較，證明赫賽汀生物類似藥與原研藥相似，DIA質(zhì)譜技術(shù)可用于抗體藥物的結(jié)構(gòu)表征。

1 材料與方法

1.1儀器 ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Xevo G2 QTof MS串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，控制儀器和采集數(shù)據(jù)的MassLynx 4.1軟件，處理數(shù)據(jù)的UNIFI 1.8軟件(包含UNIFI Workstation Large Molecule Option及UNIFI Glycan Library)，均為美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2試藥 赫賽汀(上海羅氏制藥有限公司，批號：S20170008)，赫賽汀生物類似藥(武漢友芝友生物制藥有限公司提供)。鹽酸胍[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：V900385]、碘乙酰胺[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，批號：16125-5g]、胰蛋白酶[普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，批號：V511A]、二硫蘇糖醇[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，含量>99%，批號：161-0610]、碳酸氫銨(霍尼韋爾國際公司，含量>99%，批號：09830-5009)、甲酸(百靈威科技有限公司，含量98%，批號：942988)、乙腈[默克化工技術(shù)(上海)有限公司，含量>99.9%，批號：75-05-8]。 用于流動相及樣品制備的去離子水均通過默克密理博Milli-Q水系統(tǒng)制備而得。

1.3抗體完整蛋白的分析

1.3.1樣品處理 取抗體溶液(5 mg·mL-1)100 μL，加入超純水稀釋至1 mg·mL-1；進行離心(4000 r·min-1，r=32 mm，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進儀器檢測。

1.3.2色譜條件(UPLC) 色譜柱為MassPREP在線脫鹽小柱；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.2 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→30：5→70)；柱溫：65 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件 正離子模式，脫溶劑氣體溫度400 ℃，源溫度100 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，數(shù)據(jù)采集范圍：500～5000 Da。

1.4抗體輕鏈與重鏈的分析 取抗體溶液(5 mg·mL-1)20 μL，加入水稀釋至100 μL，加二硫蘇糖醇(DTT)溶液8 μL，50 ℃金屬浴30 min，放冷至室溫。加入0.5 mL 10K超濾管中，離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。取下層液，進行離心(4000 r·min-1，r=32 mm，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進儀器檢測。

1.4.1色譜條件(UPLC) 色譜柱為MassPREP在線脫鹽小柱；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.2 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→5：5→95)；柱溫：65 ℃；進樣量：5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 正離子模式，脫溶劑氣體溫度400 ℃，源溫度100 ℃，脫溶劑氣流速600 L·h-1，毛細管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，數(shù)據(jù)采集范圍：500～5000 Da。

1.5抗體肽圖分析

1.5.1樣品處理 取抗體溶液100 μL，加入鹽酸胍溶液250 μL，加二硫蘇糖醇(DTT)溶液8 μL，37 ℃金屬浴1 h。取出樣品，加碘乙酰胺溶液17 μL，室溫避光放置30 min。加入0.5 mL 10K超濾管中，離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。離心后棄去下層濾液，向上層管加入酶切緩沖溶液(碳酸氫銨25 mM)0.4 mL，再次離心(13 000 r·min-1，r=32 mm，10 min)。重復(fù)上步操作，離心時間改為5 min。離心后，將上層管中的濃縮液轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中。加入活化后的胰蛋白酶溶液(Trypsin酶切位點：K賴氨酸、R精氨酸羧基端)100 μL，渦旋混勻，37℃金屬浴孵化過夜(16～18 h)。取出樣品，加入10%甲酸溶液10 μL。對酶解后的樣品進行離心(4000 r·min-1，1 min)，取上清液，加入到內(nèi)插管，準(zhǔn)備進儀器檢測。

1.5.2色譜條件(UPLC) 色譜柱為 ACQUITYUPIC BEH 130 C18(150 mm×2.1 mm，17 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液；洗脫程序：流速：0.3 mL·min-1，洗脫梯度(體積比95→30：5→70)；柱溫：65 ℃；進樣量：5 μL。

1.5.3質(zhì)譜條件 與“1.3.3”項相同。

①DIA掃描參數(shù)及校正設(shè)置，通過質(zhì)譜碰撞池內(nèi)等頻率交替進行低碰撞能量(6 V)和高碰撞能量(20～30 V)切換，分別獲得各個肽段母離子一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)及其二級碎片數(shù)據(jù)；校正設(shè)置：用嵌入式輔助泵持續(xù)注射1 g·L-1亮氨酸腦啡肽溶液(溶于50%乙腈水溶液，添加0.1%甲酸)，流速0.2 mL·min-1，用于獲得Lock-mass參比質(zhì)量信號，對所測得的質(zhì)量數(shù)進行實時校正。

②UNIFI軟件參數(shù)的設(shè)置，選擇胰蛋白酶(Trypsin)完全裂解作為確定抗體藥物一級序列的軟件參數(shù)，肽段漏切(Miss cleavages)設(shè)為1，不考慮非特異性酶切對序列覆蓋率的貢獻。賴氨酸末端缺失(M-128.09)、半胱氨酸脲甲基化(Mr+57.00)、N-去酰胺化(天冬氨酸和異天冬氨酸產(chǎn)物，Mr+0.98)，M-氧化(Mr+15.99)和已知的存在于抗體藥物中的寡糖選為可變修飾。母離子和碎片離子的質(zhì)量偏差均設(shè)為3/100 000。

2 結(jié)果

2.1抗體完整蛋白的分析 赫賽汀單抗包含2條輕鏈和2條重鏈，輕鏈和重鏈通過二硫鍵相連接[6]。應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，測定單抗完整蛋白，利用UNIFI軟件內(nèi)嵌入的MaxEnt 1算法對采集到的多價態(tài)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行去卷積化處理，得到赫賽汀單抗類似藥分子的平均Mr。單抗原研藥和類似藥去卷積化處理后的質(zhì)譜圖(圖1)顯示，類似藥和原研藥Mr一致，赫賽汀類似藥與原研藥相對分子質(zhì)量的偏差在1Da以內(nèi)。單抗的的質(zhì)譜圖呈現(xiàn)多個質(zhì)譜峰，這些質(zhì)量峰是由重鏈Fc區(qū)不同N-聚糖所致[7-8]。

圖1 去卷積化赫賽汀與類似藥的質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.1 Herceptin (red) and biosimilar (blue) mass deconvolution spectrum

2.2抗體亞基輕鏈、重鏈的分析結(jié)果 單抗還原后解離為2條輕鏈和2條重鏈。通過對輕鏈和重鏈進行質(zhì)譜分析和去卷積化處理，可得到輕鏈和重鏈的準(zhǔn)確Mr[9]。赫賽汀單抗類似藥輕鏈和重鏈去卷積化處理后的質(zhì)譜圖顯示(圖2，3)，單抗類似藥輕鏈和重鏈的Mr都與原研藥一致。由于重鏈存在不同的糖基化修飾，圖3呈現(xiàn)多個質(zhì)量峰。

圖2 赫賽汀和類似藥輕鏈的去卷積化質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.2 Herceptin (red) and biosimilar (blue) light chain mass deconvolution spectrum

圖3 赫賽汀和類似藥重鏈的去卷積化質(zhì)譜圖(上原研藥、下類似藥)Fig.3 Herceptin (red) and biosimilar (blue) heavy chain mass deconvolution spectrum

2.3抗體肽圖分析結(jié)果 應(yīng)用DIA質(zhì)譜技術(shù)對單胰蛋白酶酶切后檢測到的106個肽段進行肽圖分析，類似藥的氨基酸序列覆蓋率可達99%以上。根據(jù)碎片離子數(shù)據(jù)以及通過各個CDR區(qū)(complementarity determining region)與參考峰的相對保留時間來標(biāo)注單抗的CDR肽段(圖4)。并將原研藥與類似藥的CDR肽段，進行比較分析，輕鏈上3個CDR區(qū)序列完全一致，類似藥重鏈上CDR序列雖然被切到2個肽段，但主體一致，且重鏈上另2個CDR區(qū)序列完全一致，表明類似藥與原研藥的氨基酸序列相同(CDR信息源自IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/2Dstructure-DB數(shù)據(jù)庫)。

圖4 赫賽汀肽圖(上原研藥、下類似藥)Fig.4 Herceptin (red) and biosimilar (blue) peptide map

對表面甲硫氨酸容易氧化的肽段進行位點鑒定(非變性條件下氧化)[10-11]，發(fā)現(xiàn)該抗體表面存在容易氧化的肽段6個。其中重鏈上分布5個，輕鏈上分布1個，且HC-CDR3上1個甲硫氨酸易被氧化；經(jīng)UNIFI軟件處理，通過高能量碎裂得到的“b，y”離子的準(zhǔn)確質(zhì)量，確認(rèn)了這些肽段的信息[12](圖5)。

圖5 易氧化肽段的二級碎片(b，y)離子信息Fig.5 Secondary fragment (b, y) ion information of easily oxidized peptides

基于二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的肽圖分析顯示，該單抗的N-聚糖修飾發(fā)生在重鏈的第25個酶切肽段。將利妥原研藥和類似藥的H：T25肽段質(zhì)譜圖進行比較顯示，二者的糖基化修飾一致(圖6、圖7)。

圖6 赫賽汀 H：T25肽段質(zhì)譜圖Fig.6 H：T25 peptide mass spectrum of herceptin

圖7 類似藥H：T25肽段質(zhì)譜圖Fig.7 H：T25 peptide mass spectrum of biosimilar

3 討論

筆者在本實驗依托DIA質(zhì)譜技術(shù)建立了一套抗體類藥物的結(jié)構(gòu)鑒定方法。分別從完整蛋白的層面、抗體輕重鏈的層面以及肽圖的層面，多維度對抗體藥物的結(jié)構(gòu)進行了解析；并將赫賽汀類似藥與原研藥進行比較，根據(jù)以上3個不同層面分析結(jié)果的相互驗證補充，可以對抗體類藥物結(jié)構(gòu)進行確認(rèn)。

完整蛋白的質(zhì)譜分析有助于確定生物分子是否得到正確表達以及翻譯后修飾(PTM)是否正確，可總體呈現(xiàn)該蛋白的非均一性特征。輕、重鏈的質(zhì)譜分析可以從亞基水平上確定蛋白的Mr，考察蛋白的非均一性特征。在此項研究中，應(yīng)用LC/MS獲得了抗體類藥物的完整蛋白及輕鏈和重鏈的Mr，同時確認(rèn)了糖基化修飾發(fā)生在該抗體分子的重鏈。相對于完整蛋白分析，將類似藥亞基的Mr與原研藥進行比較，可根據(jù)Mr的差別初步判定二者的一級氨基酸序列是否一致；若Mr存在差異，也可判定出差異是位于輕鏈或者重鏈。同時鑒于還原后的單抗單條重鏈僅含1個N-聚糖，糖基化修飾相對簡單，可排除由多個不同糖鏈引起的Mr的差別，從而更直接的反應(yīng)蛋白本身序列的差異。

肽圖分析是分析抗體藥物表征工作中非常重要的內(nèi)容，能獲得最全面的理化和結(jié)構(gòu)信息。DIA質(zhì)譜技術(shù)將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個可變窗口，根據(jù)m/z分布密度計算合理的窗口寬度和數(shù)量，高速、循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，該技術(shù)無需指定目標(biāo)肽段，掃描點數(shù)均勻，可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數(shù)據(jù)利用度大大提高，缺失值更少。在此項研究中，一次液質(zhì)分析可同時獲得高精確的母離子及碎片離子信息，由“低碰撞能”與“高碰撞能”兩種掃描交替構(gòu)成，分別記錄母離子及碎片信息，并通過母離子與其碎片離子具有相同色譜行為的特性進行母子離子的關(guān)聯(lián)歸屬[13-15]。基于質(zhì)譜檢測的肽圖分析可以非常方便地對蛋白質(zhì)PTM 進行詳盡且全面的表征。DIA質(zhì)譜技術(shù)獲得的碎片離子信息(二級質(zhì)譜數(shù)據(jù))可用于序列分析和PTM 的確定。在此項研究中，基于DIA質(zhì)譜技術(shù)的肽圖分析顯示，類似藥的氨基酸序列覆蓋率可達99%以上，同時還獲得了PTM 的鑒定結(jié)果。根據(jù)不同層面分析結(jié)果的相互驗證補充，可證明赫賽汀單抗類似藥與原研藥的糖基化修飾十分相似。

DIA質(zhì)譜技術(shù)可用于赫賽汀及其類似藥的結(jié)構(gòu)表征和相似性比較研究，為今后其他抗體藥物結(jié)構(gòu)表征平臺的建立提供了依據(jù)。