低氧誘導因子在急慢性腎臟病中的作用及相關藥物治療前景*

李煜，姚穎

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腎內科，武漢 430030)

HIF是一種屬于PER-ARNT-SIM (PAS)家族的異聚體蛋白質，在低氧條件下與缺氧反應元件(hypoxia response elements，HREs)結合。HIF由α和β亞單位組成，其中α亞單位的表達是氧依賴的，而β亞單位則是組成型表達。目前有3個已知的α亞單位(HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α)和3個β亞單位(HIF-1β、HIF-2β和HIF-3β，也被稱為ARNT1、ARNT2和ARNT3)[6]。HIF-1α在正常組織中廣泛表達，HIF-2α是HIF-1α的同源物，它的表達受組織限制，在高度血管化的組織和器官中才可以檢測到[7]。在腎臟中，HIF -1α在大多數腎小管上皮細胞中表達，而HIF-2α主要在腎間質成纖維樣細胞和內皮細胞中表達。此外HIF -1α也在乳頭和內髓的內皮細胞和間質細胞中檢測到，但在外髓和皮質中尚未檢測到[8]。

HIF系統受到脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase，PHDs)的嚴格調節，PHDs是一種依賴2-氧戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)的雙加氧酶家族的氧敏感酶，需要氧、鐵和抗壞血酸共同作用才能發揮催化活性。在正常氧條件下，PHDs使HIF-α亞單位羥基化，在一個或兩個脯氨酸位點上的羥基化導致HIF-α與腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，pVHL)結合，pVHL是泛素連接酶E3活性復合物的一部分，可導致快速泛素化和蛋白體降解[9]。PHDs一共有3種亞型，即PHD1、PHD2和PHD3。所有PHDs都在腎小管上皮細胞中表達[10]，特別是生理狀態下氧張力較低的地方，如髓袢升支粗段、遠曲小管和髓質內的集合管中高表達。除了PHDs，HIF-1抑制因子 (factors inhibiting HIF-1，FIH-1)也是一個重要的調節HIF的氧敏感酶。HIF-α可以被反式激活結構域中天冬酰胺殘基上的FIH-1羥基化，從而破壞HIF-α和轉錄輔激活因子p300/CBP之間的相互作用，削弱剩余的HIF轉錄活性[11]。PHDs和FIH-1之間對氧氣的親和力略有不同，這意味著在低于生理氧濃度的情況下，PHDs的酶活性會先降低，當氧濃度進一步降低時將抑制FIH-1的活性，從而增加HIF的穩定性和功能[12]。FIH在腎臟的遠端小管和足細胞中高表達，但部位不同似乎作用各異，在遠端小管中可限制HIF-1α靶基因的表達，但對足細胞中的一些靶基因，如CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4，CXCR4)和血管內皮生長因子 A重組蛋白(recombinant vascular endothelial growth factor A，VEGFA)則具有潛在的HIF非依賴性轉錄效應[13]。

2 HIF相關靶基因及其在腎臟疾病中的作用

2.1HIF相關靶基因 HIF系統的調控十分復雜，根據外界空氣或組織中氧的存在與否，數百個基因對HIF信號產生反應。其中紅細胞生成、血管生成和糖無氧代謝分別受到EPO、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和糖酵解基因的調控，是腎臟損傷和修復中最重要的缺氧反應。

2.1.1紅細胞生成 EPO是一種由腎臟和肝臟分泌的造血生長因子，通過促進骨髓中紅細胞的生成進而增強血液的攜氧能力。腎臟作為機體中重要的氧傳感器對全身缺氧做出反應，然后通過腎皮質成纖維樣細胞快速增加EPO的產生[14]。HIF可與EPO位點的調控DNA序列結合促進EPO的生成，除此之外HIF還可通過影響鐵處理和代謝的基因，促進鐵元素吸收及利用。CKD患者中往往存在著不同程度絕對性缺鐵或功能性缺鐵，這種鐵的利用障礙受到鐵調素的影響。鐵調素通過抑制鐵轉運蛋白減少飲食中鐵的吸收并阻止儲存的鐵從巨噬細胞和肝臟中釋放，從而減少儲存鐵的利用和紅細胞生成[15]。HIF還通過上調跨膜絲氨酸蛋白酶-6 (transmembrane serine protease-6，TMPRSS6)的表達而降低鐵調素，TMPRSS6作為鐵調素的負調節因子已被證明可以裂解鐵調素調節蛋白(hemojuvelin，HJV)，進而降低膜上可結合的HJV，減少鐵調素的表達[16]。

2.1.2血管生成 缺氧時VEGF的表達主要受HIF-1α調節，VEGF是最有效的內皮特異性有絲分裂原，它招募內皮細胞進入缺氧和無血管區，通過激活酪氨酸激酶受體直接參與血管生成并刺激其增殖[17]。腎臟中腎小球的功能依賴于VEGF，當足細胞來源的VEGF在腎小球中過度表達可能會導致腎小球的塌陷[18]。然而抑制足細胞來源的VEGF表達會破壞腎小球濾過屏障，導致蛋白滲漏和腎小球血栓性微血管病[19]。

2.1.3葡萄糖代謝 根據灌注情況的不同，腎臟中特別是腎皮質的氧氣供應會有很大的不同。其中小管細胞通過糖酵解產生ATP的能力非常有限，導致在維持氧化代謝過程中快速消耗和高度依賴氧氣。這使腎臟在缺血、缺氧狀態下容易受到損傷。HIF主要通過激活葡萄糖轉運蛋白(glucose transporters，GLUT)1和3的轉錄來促進葡萄糖攝取，同時增強糖酵解過程中能量的產生。但實際上它同時上調了大多數糖酵解酶，包括己糖激酶1/2(hexokinase1/2，HK1/2)、烯醇化酶(enolase1，ENO1)、磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase1，PGK1)和M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase，PKM2)。此外HIF還增加了促進乳酸合成和排泄的蛋白質，如乳酸脫氫酶(LDH)、單羧酸轉運體(monocarboxylate transporters 4，MCT4)[20]。并且HIF還可刺激丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK1)和Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3 (recombinant Bcl2/adenovirus E1B interacting protein 3，BNIP3)的表達，降低線粒體氧消耗和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生[21]。

2.2HIF與AKI AKI是由多種原因引起腎功能短時間內腎功能突然下降。越來越多的證據表明腎缺氧是不同病因所致AKI的共同特征，細胞缺氧在AKI中致病作用受到了越來越多的關注。在生理狀態下較低的外髓質的氧張力下降可迅速導致能量剝奪，從而造成細胞損傷。腎缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是引起AKI的主要原因之一，許多研究已經證實HIF在IRI中發揮重要作用。PHDs抑制劑通過激活HIF-1α及HIF-2α，繼而上調相關HIF靶基因以減少細胞凋亡、巨噬細胞浸潤和血管細胞粘附分子1 (vascular cell adhesion molecule，VCAM1)的表達，最終減輕腎臟損傷[22]。在IRI后6 h給予粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)和干細胞因子(stem cell factor，SCF)也可以激活HIF，繼而上調VEGF和EPO的表達，減輕腎組織損傷程度[23]。但也有部分研究顯示在腎缺血后給予PHDs抑制劑并不能減輕AKI[24]。

此外microRNAs也被證實在缺血性AKI中發揮重要作用。一方面HIF可誘導microRNA-489相關靶基因保護腎近端小管、誘導microRNA-668抑制MTP18的表達而保護線粒體動力學、下調microRNA-127-3p的表達促進Ⅰ型膠原和α-SMA的誘導和E-鈣粘蛋白的丟失[25-27]，多方面作用均使得microRNAs在缺血性AKI中起到保護腎功能的作用。另一方面HIF也可誘導microRNAs的表達而加重損傷。研究顯示通過阻斷microRNA-687促進PTEN的表達，減少了腎細胞的凋亡和細胞周期激活繼而減輕腎損傷。在缺血性AKI中HIF誘導microRNA-687在近端小管細胞中表達增加，可能會加重腎損傷[28]。雖然HIF在AKI中詳細的作用機制尚未明了，但以上研究均顯示出HIF在缺血性AKI中的重要作用，有希望成為新的治療靶點。細胞毒性則是導致AKI另一個重要病理因素，在感染性疾病中也可引起AKI，全身炎癥反應可以由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或其他微生物成分進入淋巴和循環系統引起。有研究表明磷酸化的NF-κB、p65、HIF-1α在LPS誘導的腎損傷中同時過表達，而EPO通過降低HIF-1α和NF-κB的表達來減輕敗血癥所致AKI[29]。順鉑是一種常見的容易引起AKI的化療藥物，其對腎臟的毒性主要與腎小管的凋亡、炎癥和壞死有關。在一項應用HIF-脯氨酰羥化酶抑制劑(HIF-PHI)對順鉑誘導的AKI小鼠腎功能和形態學影響的研究中，發現用順鉑處理的小鼠其腎臟病理特征為腎小管擴張、管狀細胞壞死和蛋白管型；HIF-PHI治療后這些組織學變化明顯減輕，并且在治療過程中HIF-PHI對小鼠的腎功能及腎臟形態方面沒有明顯的副作用[30]。

2.3HIF與腎臟修復及纖維化 在發生AKI后腎臟有能力修復受損的腎小管，根據受損的嚴重程度可分為完全性修復和不完全修復。其中不完全修復以未分化和萎縮的腎小管和持續性炎癥為特征，導致腎間質纖維化并在未來可能進展為CKD[31-32]。在IRI過程中HIF通過促進組織修復基因的表達，成為近端上皮細胞再生的關鍵因子[33]。HIF通過上調EPO刺激細胞再生、抑制凋亡細胞死亡來增強組織修復[34]，并誘導基質細胞衍生因子-1 (stromal cell derived factor-1，SDF-1)促進祖細胞的募集以再生組織[35]。在殘腎模型中，HIF的活化增加了增殖的腎小球和管周內皮細胞的數量來保護管周毛細血管網。HIF在殘腎模型中被證實可以減輕腎小管間質損傷和減少纖維化[36]。KAPITSINOU等[37]證實，在IRI缺血前通過PHD抑制劑GSK1002083A激活HIF可改善AKI誘導的纖維化，但缺血后再應用PHD抑制劑對腎纖維化沒有影響。進一步的研究證實HIF在殘腎模型中對腎臟的保護作用依賴于HIF激活的亞型和不同的時機，在早期給予PHD抑制劑可加速腎纖維化，而晚期用藥則減輕腎纖維化[38]。早期給予PHD抑制劑同時激活了HIF-1α和HIF-2α，而晚期予以PHD抑制劑只激活了HIF-2α，對HIF-1α沒有影響[39]。同時HIF的激活效應可能是激活的細胞類型特異性有關。在單側輸尿管梗阻模型中，腎近端小管特異性HIF-1的抑制可減少纖維化和炎癥，而髓樣細胞源性HIF則在大鼠急性梗阻性腎損傷模型中展現出相反結果[40]。

2.4HIF與CKD CKD目前已成為全球重要的公共健康問題，據統計全球CKD平均患病率13.4%，中國CKD患病率高達10.8%[41]。貧血是CKD患者的常見并發癥之一，美國國家健康和營養調查報告顯示美國CKD患者貧血發生率是普通人群的2倍，CKD3期患者的貧血發生率已接近50%[42]。有資料表明中國非透析CKD患者腎性貧血患病率為51.5%，透析患者則高達98.2%。貧血增加CKD患者心血管風險和死亡風險，是CKD合并心血管并發癥的獨立危險因素。由于缺氧環境下HIF可促進紅細胞生成，調控HIF-PHD軸成為治療貧血的新方向。低氧誘導因子-脯氨酰羥化酶抑制劑(HIF-PHI)是一類通過在常氧狀態下抑制PHDs的活性使得體內HIF積累從而發揮作用的一類藥物。在已發表的Ⅱ期臨床試驗中，HIF-PHI療法在非透析依賴性的CKD(non-dialysis-dependent chronic kidney disease，NDD-CKD)和透析依賴的CKD(dialysis-dependent CKD，DD-CKD)患者中升高血紅蛋白水平的效果至少與傳統促紅細胞生成素刺激劑(erythropoietin stimulating agents，ESA)療效相同，同時在HIF-PHI的治療過程中還觀察到它可以降低患者血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[43]。其作用機制可能是HIF在糖酵解過程中刺激丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase，PDK)的表達，而PDK可抑制丙酮酸脫氫酶復合物阻止丙酮酸轉化為乙酰CoA，從而減少了膽固醇合成的原料；同時HIF-1通過胰島素誘導基因-2(insulin inducible gene-2，INSIG-2)途徑激活INSIG-2轉錄，導致INSIG-2蛋白的積累并與HMG CoA還原酶(HMGCR)結合，促進(HMG CoA reductase，HMGCR)的泛素化與降解[44]。此外HIF還參與調節體內神經酰胺水平，在腸道中神經酰胺主要通過直接或間接調節CD36和SREBP1C信號通路上調脂肪酸的攝取和合成。HIF-2α通過結合HRE1直接上調Acer2基因的表達促進神經酰胺分解代謝，從而降低膽固醇[45]。關于HIF-PHI在腎臟病中更多的應用有待于更多的臨床數據支撐。

3 HIF-PHI藥物臨床研究現狀

HIF-PHI是CKD患者治療貧血的一項新選擇，這種新型小分子口服藥物通過抑制PHDs的活性模擬缺氧，使得HIF-α增加，進而導致內源性EPO水平和鐵利用率升高來治療貧血[46]。目前正處于臨床研究的藥物主要包括羅沙司他、達普司他(daprodustat)、molidustat、desidustat、enarodustat、vadadustat等等，羅沙司他是國內首個獲批用于治療血液透析或腹膜透析患者貧血的HIF-PHI，2020年第2個HIF-PHI新藥獲批在日本上市，用以治療腎性貧血。其中羅沙司他在透析、非透析CKD患者的臨床試驗中均顯示可以提高血紅蛋白和EPO，降低鐵調素水平，在研究過程中顯示出良好的耐受性，沒有增加心血管事件發生率及死亡率。主要的不良反應表現為高血壓及轉鐵蛋白飽和度降低[47]。在一篇關于HIF-PHI治療NDD-CKD患者貧血的安全性和有效性Meta分析中，結果顯示了8項使用HIF-PHI與安慰藥對照的臨床試驗，HIF-PHI顯著改善了NDD-CKD患者的Hb值(P<0.00001)，同時鐵蛋白、鐵調素均有顯著性差異。與安慰藥組相比不良反應率并無統計學差異。HIF-PHI組鐵蛋白顯著性降低并不代表NDD-CKD患者出現缺鐵，由于CKD患者常伴隨著鐵利用障礙、絕對或相對性缺鐵，轉鐵蛋白飽和度(TAST)可能是更好評價患者是否缺鐵的指標[48]。在未予補鐵治療的CKD患者中發現每周3次口服羅沙司他可以顯著提高血紅蛋白水平，同時不需要對該人群短期內給予補鐵治療[49]。 羅沙司他與EPO在透析患者中的療效和安全性對比中，使用羅沙司他組主要的不良反應表現為高鉀血癥和代謝性酸中毒，而EPO組主要的不良反應表現為高血壓[50]。達普司他是葛蘭素史克公司開發的HIF-PHI，它可以抑制3種PHD，但優先選擇PHD1和PHD3，并且穩定HIF-1α和HIF-2α。達普司他在與安慰藥對照的CKD 3-5期和透析患者臨床試驗中觀察到患者接受持續4周，每天0.5～100 mg的藥物治療，在短期內達普司他可在不增加不良反應的情況下改善了貧血和提高鐵的利用率。達普司他的主要不良反應是惡心、腹痛、消化不良。在接受每天100 mg持續4周的治療過程中，60%患者出現了不良反應，因此不良反應的發生可能與較大劑量有關[51]。達普司他在每周3次10～30 mg的不同給藥劑量中提高血紅蛋白的水平呈現為劑量依賴型，同時在每周3次30 mg給藥時沒有發現新的安全性問題[52]。至于molidustat、 desidustat、enarodustat、vadadustat等HIF-PHI制劑在與安慰藥相比的研究中，除vadadustat外，其他HIF-PHI均在增加Hb水平方面顯著優于ESA，且沒有發現HIF-PHI增加全因死亡率風險。這些結果支持了HIF-PHI在CKD患者貧血治療中的應用[53]。以往使用ESA治療CKD患者貧血過程中為了達到較高的血紅蛋白目標水平可能伴有大劑量的ESA使用，增加了患者EPO抵抗和心血管事件的風險，而HIF-PHI通過內源性增加EPO并使其維持在生理水平是使用HIF-PHI的一個顯著優勢，它可以避免EPO過載，這可能有助于減少CKD患者心血管事件的發生率。另外由于HIF-PHI上調參與血管生成和腫瘤生長的其他缺氧敏感基因，在長期干預過程中的腫瘤風險值得我們關注，需要更長時間的隨訪觀察證實其安全性[54]。

4 展望

HIF對體內的氧穩態系統調節起著重要調控作用，通過調節糖、脂代謝，細胞增殖、血管生成等方面激活誘導內源性缺氧防御機制的能力，因此通過靶向激活HIF有很大的治療潛力。目前有研究表明缺氧時細胞的外泌體對腎小管細胞損傷有保護作用，HIF在缺氧時可促進腎臟近端小管外泌體的產生并能抑制ATP耗竭后的小管細胞凋亡，有助于外泌體對細胞的保護作用。外泌體是細胞產生和分泌的納米大小的囊泡，它的內容物包括不同的蛋白質、RNA、DNA和其他類型的分子。通過運輸到其他細胞釋放它們的內容物從而介導細胞間通訊，但現在外泌體在腎臟組織和細胞中的產生機制和功能仍不完全清楚[55]。此外，髓樣細胞源性的HIF被證明在單核細胞聚集并活化的腎臟炎癥性損傷中起關鍵作用，激活HIF可以抑制腎臟中的炎癥反應，是否可以通過藥物靶向激活HIF從而控制炎癥需要進一步研究[56]。

當前雖然已經批準羅沙司他及達普司他上市用于治療腎性貧血，但這兩個藥物均為非選擇性PHD抑制劑，而3種PHD亞型具有不同的特征包括對HIF-α亞型的目標選擇性和細胞類型中的表達水平均有不同。若能開發特異性PHDs抑制劑的藥物有望更安全。此外，羅沙司他對順鉑誘導的小鼠AKI模型能改善腎臟損傷、凋亡和炎癥[30]，這有可能擴大HIF-PHI在貧血治療以外的急性腎損傷治療中的臨床應用。同時由于HIF-2α直接調控神經氨酸酶3(neuraminidase 3，Neu3)的表達從而調節神經酰胺和脂肪酸的合成，HIF-2α-NEU 3-神經酰胺軸成為治療的潛在靶點。PT2385是一種口服生物可利用的HIF-2α拮抗劑，通過變構阻斷HIF-2α和HIF-β之間的異二聚化作用，特異性抑制HIF-2α的轉錄活性。研究證實PT2385在小鼠中通過抑制腸道HIF-2α信號可顯著預防和逆轉肥胖和肝脂肪變性，隨后降低腸道和血清神經酰胺水平[57]。

迄今為止其他正在進行早期研究的大多數抑制劑都是HIF-1α的間接抑制劑，目前報道最多的是金剛烷基和硼基抑制劑。金剛烷基衍生物LW6是一種線粒體蘋果酸脫氫酶2抑制劑(mitochondrial malate dehydrogenase 2，MDH2)，可降低HIF-1α的聚集而不影響HIF-1α mRNA水平和HIF-1β的表達。硼基抑制劑GN26361通過抑制VEGF mRNA的表達而不影響HIF-1α mRNA的表達來抑制HIF-1α蛋白積累[58]。

鑒于HIF的調節途徑和機制十分復雜，高達1%的基因對缺氧敏感，而HIF長期、過度抑制可能影響重要的生理過程和正常組織，因此如何更加準確地進行HIF靶向精準調控將是未來努力的重要方向。