外泌體在肝細胞癌發生發展中的作用及潛在臨床價值

羅業浩，許棟涵，呂 挺，趙鐵建，汪 磊

1 廣西中醫藥大學 壯醫方藥基礎與應用研究重點實驗室，南寧 530200；2 澳門科技大學 中醫學院，澳門 999078； 3 湖北民族大學 醫學部，湖北 恩施 445000；4 廣西中醫藥大學 賽恩斯新醫藥學院，南寧 530200

肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，HCC是肝癌的主要類型，約占原發性肝癌的85%。死亡率居全球第三，每年死亡人數超過80萬，生存期僅有3～6個月，5年生存率僅為6%[1]，大多數HCC病例由于慢性肝病、肝硬化等危險因素導致，具有起病隱匿、發生發展迅速及死亡率高的特點[2]。因此，尋找有助于HCC早期診斷、治療和預后判斷的生物標志物至關重要。外泌體包含多種生物活性物質，如蛋白質、DNA、miRNA、lncRNA、mRNA、腫瘤基因和轉錄因子等，這些生物活性物質的水平與腫瘤侵襲力和腫瘤微環境有一定關系，可通過介導HCC的相關信號通路，加劇HCC的發生、發展[3]。外泌體有可能成為早期診斷HCC或轉移的標志物，因此，充分了解外泌體對HCC進展的作用機制，對其早期診斷、治療具有重要價值。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的來源及包含成分 外泌體是大小在30～150 nm之間的小細胞外囊泡，是細胞外囊泡的一種亞型，通過在多囊泡體中內吞形成腔內囊泡。胞內多泡體可以與溶酶體融合，導致內容物降解，并且它們還與質膜融合，將內容物作為外泌體釋放到細胞外空間，由所有細胞類型分泌并負責細胞間通訊[4]。外泌體由包括腫瘤細胞在內的各種身體組成細胞[如紅細胞、血小板、淋巴細胞、巨噬細胞、脂肪組織來源的間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AMSC)、成纖維細胞及腫瘤細胞間質細胞等]分泌，廣泛存在于人體的血液、唾液、尿液、腹水和腦脊液中。外泌體包含了蛋白質、脂質和核酸等生物大分子，如mRNA、miRNA等[5]。

1.2 外泌體的生物學功能 外泌體的功能取決于其來源的細胞類型。一般來說，外泌體可參與包括細胞通訊、免疫反應、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲和血管生成在內的多種生理和病理過程[6]。主要是由于其具有脂質雙分子層的結構特征，能夠有效保護其內容物的活性，方便其在細胞間穿梭以促進細胞間的通訊。外泌體可以與特定的受體結合，通過釋放囊泡內容物的方式進行信息傳遞，攜帶的各種細胞因子和蛋白質在細胞與其微環境之間的細胞間通信中起關鍵作用，為癌細胞的生存和生長提供合適的環境[7]。

外泌體可以作為載體啟動抗癌免疫反應，也可以運輸癌蛋白和免疫抑制分子以破壞宿主免疫系統并有利于腫瘤的微環境，幫助癌細胞免疫逃逸[8]。研究表明，HepG2細胞的外泌體激活脂肪細胞中的幾種激酶和NF-κB，并促進炎癥細胞因子的分泌、腫瘤生長和遷移、血管生成和炎癥浸潤。一旦腫瘤病灶太大而無法獲得足夠的營養，腫瘤微環境就會發生壞死和炎癥并誘導血管生成[9]。

2 外泌體在HCC發生、發展中的作用

外泌體參與HCC的形成和發展，包括重塑腫瘤微環境、細胞間通訊、免疫調節、細胞分化、遷移和侵襲、血管生成和耐藥性等，對HCC具有雙向作用(圖1)。

圖1 外泌體的組成及參與HCC的形成和發展

2.1 外泌體通過影響微環境促進肝癌的增殖、遷移 在HCC的進展過程中，具有致癌特性的外泌體逐漸超過了抑制腫瘤的外泌體，并最終將微環境轉變為致瘤性。這些外泌體促進腫瘤啟動、血管生成、上皮細胞間質轉化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)、基質重塑和免疫調節，它們協同支持腫瘤進行增殖和遷移[10]。研究表明，外泌體的分泌有可能是協調腫瘤異質性的一種機制，促進具有不同基因型細胞的協同作用，刺激表觀遺傳變異和支持轉移克隆的生長。研究[11]顯示，HCC 患者血清外泌體miRNA-665水平顯著升高，與腫瘤大小、臨床分期、局部侵襲和轉移呈正相關。如MET原癌基因可以被肝細胞內化，然后通過激活 PI3K/AKT和MAPK信號通路以及基質金屬蛋白酶 2(MMP-2)和 MMP-9 的過度表達，顯著促進非運動肝細胞的遷移和侵襲[12]。含MHC-Ⅰ分子和熱休克蛋白的腫瘤來源的外泌體增強了骨髓基質細胞的抗腫瘤活性。當在體外用腫瘤來源的外泌體脈沖時，骨髓基質細胞可以促進同源HCC的遷移。

HCC細胞來源的外泌體也可以改變微環境來促進癌細胞的增殖和轉移。Vps4A 是外泌體釋放的關鍵調節因子，可能在肝癌細胞中充當腫瘤抑制因子。它降低了細胞對外泌體的反應，抑制了外泌體的生物活性，并增強了外泌體致癌miRNA的釋放。更重要的是，PI3K/Akt 信號通路被認為是Vps4A相關miRNA最有可能的靶通路[13]。肥大細胞在腫瘤微環境中富集，也促進腫瘤的發生和發展。肥大細胞顯著增強肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，主要由HCV-E2刺激的肝癌細胞產生的外泌體將lncRNA FAL1傳遞給Huh7和HepG2細胞來發揮作用[14]。而蛋白質在HCC的發展中也起著重要作用。Vasorin (VASN)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，已被證實可促進細胞增殖和遷移[15]。實驗[16]證明，由HepG2分泌的外泌體轉運的VASN有效地促進了人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的遷移。CD90+肝癌細胞分泌的外泌體將lncH19轉移到 HUVEC，導致血管生成并促進細胞間黏附，從而改變微環境促進HCC的發展。

2.2 外泌體通過靶向內皮細胞促進肝癌血管生成 腫瘤細胞可以通過釋放外泌體中的內容物來調節內皮細胞的行為，進而增加血管通透性，促進血管生成，導致腫瘤轉移和生長。miRNA-103 在肝癌細胞的外泌體中明顯增加并可以被遞送到內皮細胞，導致內皮完整性破壞以及血管通透性增加，最終促進 HCC 轉移，其機制與抑制miRNA-103表達膜相關黏附分子，如VE-鈣粘蛋白 (VE-Cad)、p120-連環蛋白 (p120)和封閉小帶1 (ZO-1)有關[17]。HCC細胞來源的外泌體中miRNA-210、ephrin-B2、Delta-like 4 配體 (DLL4)、血管生成素-2 (ANGPT2)、circ-100338 和 VASN等6種物質被上調，并且證實與活性內皮依賴性血管生成有關。miRNA-210可以通過外泌體進入內皮細胞，然后miRNA-210直接靶向SMAD4和STAT6并下調它們的表達，從而促進內皮細胞的小管形成，最終導致腫瘤血管生成[18]。一項研究[19]發現ephrin-B2和DLL4的高表達水平是通過Notch信號通路的上調所實現的，可以使其通過外泌體進入內皮祖細胞并促進腫瘤血管生成。在HCC細胞分泌的外泌體表面檢測到高水平的ANGPT2可以將其輸送到內皮細胞，促進內皮細胞的血管生成。此外，肝癌細胞分泌的外泌體中檢測到高水平的circ-100338，它可以被輸送到內皮細胞，circ-100338不僅促進內皮細胞增殖和血管生成，還增加了血管通透性[20]。在肝癌細胞的外泌體檢測出高水平VASN，它可以通過硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPG)介導的內吞作用傳遞到內皮細胞中，促進內皮細胞遷移，導致血管生成而進一步促進肝癌的發生與發展[21]。

與上述上調的物質相反，部分外泌體中也有一些被下調的物質。研究[22]發現C型凝集素域家族3成員B (CLEC3B)在肝癌細胞分泌的外泌體中被檢測到具有低水平并且可以被遞送到內皮細胞，這可能導致AMP活化蛋白激酶(AMPK)下調信號通路，與內皮細胞中血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)水平的增加有關，高水平的VEGF增強血管生成，最終促進腫瘤進展。另一項研究[23]表明，肝癌細胞分泌的外泌體中miRNA-200b-3p低表達，同樣可以被遞送到內皮細胞中，低水平的miRNA-200b-3p通過上調轉變為增強內皮細胞的血管生成能力相關的基因。

2.3 外泌體調節EMT促進肝癌的轉移 EMT是癌癥遠處轉移的第一步。EMT定義為細胞失去上皮標志物(如 E-鈣粘蛋白)并獲得間充質細胞標志物(如 N-鈣粘蛋白)的過程[24]。腫瘤細胞通過EMT過程獲得移動性和侵襲性，從而發生轉移。已經發現間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)衍生的外泌體在許多不同癌癥類型的相鄰上皮細胞中誘導EMT[25]。癌相關成纖維細胞(carcinoma-related fibroblasts,CAF)衍生的外泌體中miRNA-320a的缺失促進了EMT和HCC轉移。HCC衍生的外泌體將miRNA-92-3p轉運至受體細胞，從而通過PTEN/Akt 通路的調節促進EMT和低轉移性HCC細胞向高轉移性HCC細胞的轉化[26]。含堿性成纖維細胞生長因子的外泌體通過激活AKT/GSK-3β/Snail/Twist1 信號通路誘導EMT和肝癌細胞的轉移。研究[27]證實，CTHRC1 mRNA與腫瘤大小和分期、微血管侵犯和肝內轉移呈正相關。CTHRC1的外泌體通過PI3K/Akt/ERK/CREB/Snail/TGFβ/MMP2信號傳導抑制膠原蛋白Ⅰ并刺激HCC細胞和EMT的遷移。在HCC組織中，lncRNA-CCAL過表達與較大的腫瘤、晚期 pTNM 分期和低凋亡率相關，它通過Wnt/β-catenin通路激活誘導EMT，從而促進肝癌細胞遷移[28]。在肺轉移生態位中，由高轉移性HCC細胞釋放的外泌體miRNA-1247-3p下調成纖維細胞中的β-1,4-半乳糖基轉移酶Ⅲ的表達，激活β1-整合素-NF-κB 信號并進一步促進肝癌的肺轉移[29]。

3 外泌體在HCC中潛在的臨床應用價值

3.1 外泌體在HCC診斷和預后判斷中的應用 由于外泌體中的RNA不受血液中降解酶的影響，而裸露的RNA會迅速降解，血清和血漿miRNA已被研究作為癌癥診斷和治療中有價值的生物標志物[30]。例如人食管鱗狀細胞癌血清外泌體miRNA-21顯著高于良性疾病，血清外泌體miRNA水平高于非外泌體miRNA。其次，外泌體反映了它們的起源組織，因為它們可以使用針對膜表面組織特異性蛋白的抗體進行免疫分離[31]。事實上，血清外泌體miRNA與腫瘤衍生的miRNA相關。有文獻[32]指出，與慢性乙型肝炎或肝臟相關慢性疾病相比，HCC患者血清中外泌體miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-222和miRNA-224的水平顯著較高，而miRNA-101的水平較低。HCC患者的血清外泌體miRNA-1247-3p較正常人的升高，較高水平的血清外泌體miRNA-1247-3p提示HCC的肺轉移預后較差。miRNA-1247-3p有望成為診斷HCC有價值的生物標志物，尤其是預測HCC肺轉移方面[33]。活體肝移植后，與未復發的HCC患者相比，復發的HCC患者其miRNA-718顯著降低。然而，僅有miRNA-718與臨床病理因素相關。低表達miRNA-718顯示出組織學分化較差、腫瘤發生率較高和腫瘤更大的相關特點[34]。不僅如此，外泌體miRNA-106b、miRNA-122和miRNA-195的水平在HCC血清中低于肝硬化。數據[35-36]表明，miRNA-10b和miRNA-21在HCC進展過程中增加，而miRNA-122、miRNA-218和miRNA-200a在外泌體中減少。ROC曲線分析顯示，AFP、miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122和miRNA-200a組合診斷HCC,其ROC曲線下面積達0.993，可以被認為是一種優越的早期診斷HCC的方法。上述結果表明，外泌體miRNA可能成為診斷和預測HCC復發及治療效果的新型生物標志物。

此外，外泌體miRNA-665過表達時HCC患者表現出更短的生存時間，這表明外泌體miRNA-665可作為HCC患者潛在的預后生物標志物[37]。血清外泌體miRNA-638在HCC患者中下調，其與生存期呈正相關，miRNA-638水平偏低，可預測HCC患者的總生存期較短[38]。血清中外泌體miRNA-125b水平與腫瘤增殖、分化和TNM分期顯著相關，外泌體衍生的miRNA-125b水平顯著高于HCC患者血清中的水平，而且miRNA-125b水平較低的HCC患者其總生存期和復發率較短[39]。外泌體miRNA-125b可以作為HCC患者的預后標志物。

外泌體CASC9和LUCAT1在HCC衍生細胞系的一個子集中上調，兩者都與HCC患者術后的腫瘤大小和復發有關[40]。

3.2 外泌體在HCC治療中的應用 早期 HCC 最常用的治療方法主要是手術切除、肝移植和介入放射學。然而，大多數HCC患者被診斷時已是晚期，預后差。經肝動脈化療栓塞術是多結節中期 HCC患者的一線治療方法，但由于缺氧和代償性血運重建，其效果欠佳。索拉非尼是晚期 HCC唯一的全身用藥，但容易產生耐藥性[41]。

來自HCC細胞的外泌體通過激活HGF/c-Met/Akt通路在體外增強了肝癌細胞對索拉非尼的抵抗力，并逆轉了索拉非尼誘導的HCC細胞凋亡。此外，與侵襲性較低的HCC細胞來源的外泌體相比，高侵襲性HCC細胞來源的外泌體在逆轉索拉非尼誘導的細胞凋亡方面具有更大的作用[42]。脂肪組織來源的AMSC 將miRNA-122包裝成分泌的外泌體，然后外泌體在體外將miRNA-122遞送到HCC細胞中，介導AMSC和HCC細胞之間的通訊。而且，miRNA-122修飾的AMSC衍生的外泌體通過增加細胞周期停滯和凋亡來增強HCC細胞的化學敏感性，從而促進索拉非尼對HCC細胞的敏感性[43]。miRNA-335-5p可以通過成纖維細胞釋放的外泌體被HCC細胞攝取。作為HCC的腫瘤抑制因子，miRNA-335-5p抑制HCC細胞的生長、增殖、侵襲和凋亡[44]。miRNA-320a被轉移到HCC細胞，然后通過抑制PBX3表達和MAPK通路激活來抑制HCC細胞增殖、遷移和轉移。外泌體miRNA-9-3p在HCC中減少，并通過靶向成纖維細胞生長因子5 (fibroblast growth factor 5,HBGF-5)影響細胞增殖，HBGF-5也可能是HCC的潛在治療靶點[45]。

越來越多的研究表明，外泌體衍生的相互作用可以調節耐受性和免疫抑制性微環境，外泌體能夠在體內誘導特定的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)，并以T淋巴細胞依賴性方式抑制腫瘤的生長[46]。研究[47]表明，腫瘤細胞衍生的外泌體 (tumor exosomes,TEX)可以有效地將HCC抗原攜帶到樹突細胞，導致比癌細胞裂解物更強的免疫反應。TEX脈沖樹突細胞 (DC TEX)與細胞裂解物脈沖的樹突細胞相比，顯著抑制了異位和原位HCC小鼠的腫瘤生長。此外，在原位HCC小鼠中，DC TEX治療通過增加IFNγ和T淋巴細胞，降低腫瘤部位的TGFβ和IL-10來改善免疫和腫瘤微環境。5-Aza-2′-脫氧胞苷 (5-Aza-CdR)是一種DNA去甲基化啟動子，可提高 HLA-Ⅰ和 HLA-Ⅱ等免疫分子的表達。用5-Aza-CdR處理后的HepG2和Hep3B細胞的外泌體分泌增加[48]。抗腫瘤細胞免疫所需的HSP70、HLA-Ⅰ和NY-ESO-1蛋白在這些外泌體中均升高，這可能是通過刺激抗腫瘤特異性免疫應答導致的。這些蛋白質可能為HCC免疫療法提供新的治療選擇[49]。癌癥免疫治療的目的是促進細胞內CTL的活性，協助淋巴器官中腫瘤特異性CTL的啟動，建立有效持久的抗癌免疫。在免疫治療中，通過保證CD4+T淋巴細胞向CD8+T淋巴細胞的信號傳遞和調節T淋巴細胞的代謝活動，可以優化CTL反應，從而增強抗癌免疫[50]。

4 小結與展望

在腫瘤發生發展過程中，外泌體的mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質等在細胞間轉移可改變腫瘤微環境、新生血管生成，使HCC發生增殖、侵襲和轉移。相反，外泌體同樣可調節各種生理和病理過程，也可用作癌癥治療的藥物載體，對于HCC的診斷、預后標志物及治療起到重要的作用。外泌體膜的修飾可以增加外泌體對特定病變的趨化性。因此，外泌體可以直接有效地將抗腫瘤藥物遞送至HCC 組織并阻止HCC的進展[51]。但是，外泌體在HCC診斷和治療中的臨床應用還需要進一步研究，因為當前外泌體提煉技術尚未成熟，仍迫切需要改進有效的外泌體分離、純化和儲存技術以更好地應用于臨床。在HCC中，大多數研究仍然集中于血液中的外泌體。在今后研究中，外泌體在HCC患者腹腔積液或膽汁中的檢測技術將是有潛力的可開發領域。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：羅業浩負責課題設計，資料分析及撰寫論文；許棟涵、呂挺參與收集數據及修改論文；趙鐵建、汪磊負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。