囊胚發育速度和形態學參數與整倍體狀態及妊娠結局的相關性

陳夢茜，王瑩，周林，曹善仁，武恂，凌秀鳳，張軍強

(南京醫科大學附屬婦產醫院生殖醫學中心，江蘇 南京 210004)

自1978年第一位試管嬰兒誕生至今，輔助生殖技術經歷了高速發展的40余年，其培養條件及操作技術日益完善，成功率日趨穩定。近年來，隨著囊胚培養技術的發展成熟及玻璃化冷凍技術的完善，為胚胎復蘇移植創造了充分條件。如今，輔助生殖技術已經從以往的追求成功率向注重母體和子代的長遠健康轉變，單囊胚移植在獲得較理想的臨床妊娠率的同時可以有效降低多胎妊娠率和流產率[1]，實行單胚胎移植已逐漸受到大眾的認可。因此，如何選擇真正具有發育潛能的胚胎移植成為需要解決的關鍵問題之一[2-4]。當前的臨床工作中，普遍優先選擇受精后發育至第5天即形成囊胚，且形態學評分高的胚胎進行移植，但是，當形態學評分和發育時間相互沖突時，如何選擇優先移植的胚胎尚存在爭議[5-6]。胚胎植入前遺傳學檢測技術主要包括：胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)，即對于高齡、反復種植失敗、復發性流產、不良孕產史等患者做胚胎整倍體篩查；植入前結構重排基因檢測，即針對夫妻雙方中有一方或雙方存在染色體異常，如平衡易位等，檢測其胚胎是否具有染色體結構異常；胚胎植入前單基因遺傳學檢測，即檢測胚胎是否有一些可造成單基因病的遺傳基因。PGT-A操作復雜、昂貴且有創，并且有嚴格的適應證；目前，國內僅有少量中心有資質開展PGT-A。傳統的胚胎形態學評估方法操作便捷、簡單經濟且無創，是最常規的評價胚胎發育潛能的方法。如果將兩者結合，利用傳統胚胎形態學評分的各個關鍵參數來探索胚胎的整倍體性及后續發育潛能，有望在囊胚移植時更精準地優選胚胎。因此，本研究擬在行PGT-A的患者中，研究囊胚發育速度及形態學評分與囊胚整倍體性及妊娠結局的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2017年10月至2021年1月于南京醫科大學附屬婦產醫院生殖醫學中心行PGT-A助孕的患者。納入標準：符合PGT-A指征；至少有1枚囊胚進行活檢并且送檢；排除標準：夫妻雙方中有一方或兩方存在染色體異常；行胚胎植入前單體型連鎖分析技術患者；因單基因病行胚胎植入前單基因遺傳學檢測患者。

1.2 促排卵方案及授精方式

根據患者個體情況采用相應的促排卵方案進行促排卵，取卵日行超聲引導下卵泡穿刺術。所有PGT-A周期均采用卵胞質內單精子注射進行授精。卵胞質內單精子注射后置于G1 plus培養液(瑞典Vitrolife公司)中進行培養，受精后16～18 h觀察并記錄受精情況；雙原核為正常受精。

1.3 胚胎培養

待胚胎發育至第3天時觀察胚胎的卵裂情況；將全部可用胚胎置于G2 plus培養液(瑞典Vitrolife公司)中進行囊胚培養。

1.4 囊胚觀察與活檢

囊胚評估采用Gardner評分標準[7]進行評分，分別在第5、6、7天進行觀察，選擇囊胚擴張程度為4期及以上，內細胞團評分在B級以上，滋養層評分在C級以上的囊胚進行活檢。囊胚活檢時，在遠離內細胞團處用激光對透明帶打孔，用活檢針緩緩吸入4～5枚滋養層細胞，激發3～4次激光切割細胞連接最薄弱處，使目標滋養層細胞與囊胚分離；將取下的細胞置于PCR管中備檢，活檢細胞行遺傳學檢測，檢測方法為二代測序；囊胚活檢后按每管一枚胚胎進行玻璃化冷凍。

1.5 胚胎移植及隨訪

子宮內膜準備方案包括自然周期方案及人工周期方案，排卵或黃體轉化后第5天行囊胚移植。根據PGT-A檢測結果，選擇可移植囊胚進行單囊胚解凍移植，術后給予常規黃體支持。移植后14 d測血人絨毛膜促性腺激素，移植后28 d行超聲檢查，見孕囊及監測到胎心即為臨床妊娠。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 患者一般資料

共納入173例患者的237個PGT-A周期；共活檢1 026枚胚胎，其中51枚因擴增失敗、無檢測信號或結果無法判讀而未得到整倍體狀態檢測結果。在剩余975枚囊胚中，整倍體囊胚為479枚(49.13%)，非整倍體囊胚為496枚(50.87%)。截至2021年1月31日，237個PGT-A周期中，除48個周期無可移植胚胎外，已完成127個周期胚胎移植。

2.2 囊胚發育速度、擴張程度、內細胞團及滋養層級別對囊胚整倍體率的影響

與第5天胚胎相比，第6、7天形成胚胎整倍體率顯著降低(P<0.001)，調整年齡后，差異仍有統計學意義(P=0.001)；與4期囊胚相比，5期及6期囊胚整倍體率差異無統計學意義(P=0.061，0.113)，調整年齡后，差異仍無統計學意義(P=0.132，0.109)；與囊胚內細胞團A級別相比，B級別整倍體率顯著降低(P<0.001)，調整年齡后，差異仍有統計學意義(P<0.001)；囊胚滋養層B級別與A級別相比，整倍體率差異無統計學意義(P=0.373)，調整年齡后差異仍無統計學意義(P=0.233)；滋養層C級別與A級別相比，囊胚整倍體率顯著降低(P=0.001)，調整年齡后差異仍有統計學意義(P=0.001)。見表1。

表1 囊胚發育速度和形態學參數與其整倍體率的關系

2.3 囊胚發育速度、擴張程度、內細胞團及滋養層級別對妊娠結局的影響

共完成整倍體單囊胚移植127個周期，其中第5天移植68個，第6天移植57個，第7天移植2個。調整年齡前，臨床妊娠率在不同囊胚形成時間組、不同囊胚擴張程度組、不同內細胞團級別組、不同滋養層細胞組之間差異均無統計學意義(P均>0.05)。

調整年齡因素后，在整倍體囊胚中，不同發育速度的胚胎間臨床妊娠率差異無統計學意義(P=0.498)；與移植4期囊胚相比，移植5期、6期囊胚后臨床妊娠率差異均無統計學意義(P=0.377，0.550)；與囊胚內細胞團A級別相比，移植B級別囊胚后臨床妊娠率差異無統計學意義(P=0.618)；與囊胚滋養層A級別相比，B、C級別臨床妊娠率差異無統計學意義(P=0.740，0.995)。見表2。

表2 囊胚發育速度和形態學參數與臨床妊娠率的關系

3 討論

既往研究表明[8-9]，PGT-A整倍體率隨女方年齡增長而下降，在女方年齡大于35歲后，下降更為明顯；另外，女方年齡是影響妊娠結局的決定性因素。本研究中，有95個活檢周期女方年齡大于35歲，因此，將女方年齡作為首要調整因素納入分析。

國內外有多項研究表明，囊胚擴張程度與整倍體率顯著相關，2016年意大利一項研究顯示[10]，與1～2期囊胚整倍體率(5.1%)相比，5～6期囊胚整倍體率顯著提高(81.1%，P=0.026)；2018年美國一項研究表明[11]，5～6期囊胚整倍體率(48.8%)顯著高于3～4期囊胚(32.2%，P<0.01)。上述國外研究的囊胚擴張程度都按1～2期、3～4期、5～6期分組，而國內大多將囊胚培養至4期以上才進行活檢。申春艷等[12]研究中4期囊胚占比為90.2%，本研究中4期囊胚占比為88.3%(861/975)，與其相一致，但4期與5期、6期囊胚數量相差懸殊，因此導致相關性無統計學差異。

關于胚胎發育速度與整倍體率的關系，目前的研究呈現兩種不同的結果，有研究表明胚胎發育速度與整倍體率無明顯相關[10, 13]，也有研究表明第6、7天活檢的囊胚整倍體率較第5天低[14-15]；本研究結果與后者一致，這可能與選擇標準的不同相關，即本研究嚴格要求囊胚在發育到4期才會進行活檢，而部分研究在第4天即開始活檢，且未要求發育至4期。另外，有研究結合時差成像系統觀察數據分析，結果顯示非整倍體胚胎發育速度更慢[15]。目前臨床研究表明，移植第5天囊胚的妊娠率明顯高于第6天。研究表明，一些導致胚胎非整倍體的因素，如線粒體或基因表達缺陷、線粒體DNA含量低、紡錘體異常等，都會表現為胚胎發育速度緩慢[16-18]。結合中心質控數據及既往基礎和臨床研究[19]，南京醫科大學附屬婦產醫院生殖醫學中心在實際工作中，會選擇優先移植第5天的囊胚，以期獲得更好的妊娠結局。

本研究結果顯示，囊胚內細胞團及滋養層細胞級別對整倍體率有顯著影響；內細胞團B級別的囊胚整倍體率顯著低于A級別；C級別滋養層細胞囊胚整倍體率顯著低于A級別，B級別滋養層細胞囊胚整倍體率雖低于A級別，但差異無統計學意義，因此優質囊胚的整倍體率高于非優質囊胚。國內外研究均表明[15, 20-21]，囊胚內細胞團和滋養層細胞級別與整倍體性顯著相關，級別高者更有可能是整倍體，本研究結果與其一致。因此，胚胎發育早期內細胞團和滋養層細胞狀態可作為預測胚胎整倍體結果的重要參考。

對于高齡、反復種植失敗、復發性流產、不良孕產史等患者，PGT-A均可有效改善妊娠結局[22-24]；不同指征患者的整倍體率和臨床妊娠率均存在差異[24]，高齡患者較復發性流產患者可獲得更高的胚胎整倍體率、臨床妊娠率和持續妊娠率[25]。在PGT-A患者中，對于移植第5天和第6天的胚胎，兩者臨床妊娠率和早期流產率均無統計學差異[10]；本研究中移植第5天和第6天的囊胚臨床妊娠率也無統計學差異，由此提示在整倍體胚胎中，胚胎發育速度對臨床妊娠的影響不大，第5天胚胎和第6天胚胎價值等同，這可以為PGT-A患者在選擇胚胎時提供參考。另外，本研究結果顯示，在不同的囊胚擴張程度與不同級別的內細胞團、滋養層細胞之間臨床妊娠率也無統計學差異。對于未行PGT-A檢測的患者，囊胚發育速度、內細胞團級別、滋養層細胞級別可作為確定胚胎移植順序的參考依據，囊胚擴張程度不作為主要考慮因素，優先選擇第5天、內細胞團A級和滋養層細胞A、B級的胚胎。

本研究所有數據均來自同一中心，所有PGT-A均采用二代測序測方法檢測，盡可能減少了培養體系和技術相關的偏差。本研究的局限性在于未能結合時差成像系統精準評價胚胎發育速度，且由于樣本量的限制，未按不同的病因進行分組分析；另外，由于采集信息時間的問題，部分患者尚未完成分娩，因此僅將臨床妊娠作為妊娠結局，分娩結局及新生兒結局有待后續進一步分析。

綜上所述，PGT-A周期中，囊胚發育速度、內細胞團等級、滋養層細胞等級與整倍體狀態顯著相關，囊胚擴張程度與整倍體狀態無關；對于早期妊娠結局，整倍體胚胎復蘇移植周期的臨床妊娠率與囊胚發育速度、內細胞團等級、滋養層細胞等級及囊胚擴張程度均無相關性。