半相合細胞移植對CT-26結腸癌荷瘤小鼠的抑瘤作用

顓孫雪梅，周慶，孫茂民

(1. 蘇州大學醫學部實驗動物中心，江蘇 蘇州 215000； 2. 江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇 鎮江 212013)

結直腸癌每年造成近70萬人死亡，成為世界上第四大致命癌癥，僅次于肺癌、肝癌和胃癌[1-2]。同種異基因干細胞移植已成為治療實體瘤如結直腸癌的有效方法[3-4]。造血干細胞移植除可治療復雜的血液系統惡性腫瘤外，還可誘導對實體器官移植的耐受[5-6]；但同時又存在移植物抗宿主等不良反應[7-8]。上皮細胞是移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的靶細胞，其中，角質形成細胞、成纖維細胞和外分泌腺等產生的腫瘤易受移植物抗腫瘤(graft-versus-tumor, GVT)效應影響。在癌癥長期控制中對GVT重要性的認識使得部分患者采用非清髓性移植方案，降低了與傳統清髓性移植相關的發病率和死亡率[6]。非清髓性半相合細胞移植方案，即利用受體與供體小鼠有一半相同的基因型來降低GVHD反應強度，同時延長GVT反應時間。宿主抗原呈遞細胞可通過呈遞腫瘤抗原來激活輸注的供體淋巴細胞，從而介導癌細胞的清除[9]。為解決GVT反應伴隨嚴重的移植物抗宿主等不良反應，基于C57BL/6鼠的主要組織相容性分子背景為H-2Kb，CB6F1鼠(BALB/c × C57BL/6雜交)為H-2Kb/d，本研究以皮下種植BALB/c小鼠結腸癌CT-26細胞建立小鼠皮下荷瘤模型來評估半相合細胞移植的抗結腸癌效果。

1 材料和方法

1.1 動物、細胞與試劑

18只BALB/c小鼠[合格證號：SCXK(蘇)2017-0043]，40只C57BL/6小鼠[合格證號：SCXK(蘇)2018-0006]，6～8周齡，體質量為24～28 g，購自蘇州大學實驗動物中心。18只CB6F1小鼠在蘇州大學實驗動物中心SPF動物室繁殖，所有小鼠均飼養于蘇州大學實驗動物中心。動物實驗符合《實驗動物護理和使用指南》，并經蘇州大學動物倫理委員會批準。

BALB/c小鼠結腸癌CT-26細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。胎牛血清、DMEM高糖培養基和雙抗(美國Gibco公司)；ELISA試劑盒(碧云天試劑公司)；H-2Kb流式抗體和H-2Kd流式抗體(美國Abcam公司)；HE染色試劑盒(索萊寶科技有限公司)；環磷酰胺(源葉生物科技有限公司)。

1.2 皮下荷瘤小鼠模型構建及半相合細胞移植

1.2.1 供體小鼠脾細胞和骨髓細胞的獲取 取40只C57BL/6小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡 2 min；取小鼠脾和下肢分別放入含有PBS的培養皿中。取脾臟剪碎并研磨，將研磨液轉移至200目的細胞篩網中過濾；用PBS沖洗篩網2次；4 ℃離心棄上清液；加入2 mL紅細胞裂解液4 ℃靜置10 min；加入10 mL PBS終止裂解；離心棄上清液，PBS洗滌2次，即得到小鼠脾細胞。

取小鼠下肢用眼科鑷分離皮膚和肌肉，獲取小鼠脛骨和股骨，用紗布將脛骨和股骨處肌肉去除干凈，剪去兩端軟骨暴露紅色骨髓腔，1 mL無菌注射器吸取PBS反復沖洗2～3次，沖洗液后續處理同上述小鼠脾細胞，即得小鼠骨髓細胞。

1.2.2 荷瘤模型構建 選取18只健康CB6F1小鼠，隨機均分為3組，即對照組、環磷酰胺組和移植組，每組6只，均皮下注射5×106個CT-26結腸癌細胞(0.2 mL)，即為受體小鼠。7 d時可檢測到小鼠腫瘤體積，表明模型構建成功。

1.2.3 半相合細胞移植 對照組于小鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水；環磷酰胺組注射0.2 mL環磷酰胺；移植組在2 d時先注射0.2 mL環磷酰胺，以后注射0.2 mL 5×107個脾細胞+2×107個骨髓細胞；2次/周，連續注射4周；于移植后2、7、12、17、23、28 d時測量小鼠腫瘤體積。

2周時對照組小鼠荷瘤過大死亡；環磷酰胺組和移植組分別處死3只取其腫瘤組織、肝臟、小腸和皮膚行后續HE染色和ELISA檢測等。

1.3 HE染色觀察組織病理變化

取移植2周時3組小鼠肝臟、皮膚、小腸及腫瘤組織，石蠟包埋，切片4～6 μm；二甲苯脫蠟3次，每次7 min；乙醇梯度水化，無水乙醇、95%乙醇和75%乙醇各3 min；自來水沖洗1 min；蘇木精染色2 min；自來水沖洗5～10 min；1%鹽酸乙醇分化 3 s；自來水終止分化；1%伊紅染液染色20 s；自來水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 ELISA法檢測腫瘤組織中炎性因子水平

分別取3組小鼠腫瘤組織，加入組織勻漿緩沖液研磨，離心取上清液。將標準品和樣品加入微孔板中孵育1.5 h后洗滌3次，于各孔中加入稀釋好的生物素化抗體 (IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β) 工作液100 μL孵育1 h；洗去未結合的生物素化抗體；每孔加入HRP結合的鏈—霉親和素，室溫孵育20 min；洗滌2次；每孔加入TMB溶液100 μL，室溫避光孵育20 min；終止顯色，待顏色從藍色變為黃色時于450 nm處測量光密度值。

1.5 流式細胞儀檢測小鼠外周血嵌合比率

于移植3 d，2周和4周時取未處死的同樣3只移植組小鼠眼球血80 μL，加入紅細胞裂解液2 mL避光4 ℃孵育10 min；PBS洗滌2次，加入抗H-2Kb、H-2Kd抗體避光室溫孵育30 min；PBS洗滌2次；加入200 μL PBS，用流式細胞儀檢測小鼠外周血嵌合率。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 半相合細胞移植抑制腫瘤生長

移植2 周時對照組小鼠荷瘤過大死亡，環磷酰胺組和移植組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組(P均<0.01)；移植2、7、12、17、23 d時，移植組小鼠腫瘤體積小于環磷酰胺組，但差異無統計學意義；移植28 d時，移植組腫瘤體積顯著小于環磷酰胺組(P<0.01)。見圖1。

a: P<0.01，與對照組比較； b: P<0.01，與移植組比較；A：移植2周時各組小鼠腫瘤體積比較(n=3)； B：不同時間點兩組小鼠腫瘤體積比較(n=3)；C：移植4周時兩組小鼠腫瘤體積(n=3)

2.2 受體鼠的移植物抗宿主反應

HE染色結果顯示，移植組肝組織匯管區淋巴細胞數少于環磷酰胺組，且組織排列整齊，未見明顯分離；移植組腸黏膜完整，且淋巴細胞數少于環磷酰胺和對照組；移植組皮膚無明顯淋巴細胞浸潤，部分上皮細胞壞死，另外兩組皮膚組織有大量淋巴細胞浸潤和基底層空泡樣病變。見圖2。

圖2 各組小鼠肝臟、小腸和皮膚組織HE染色結果(scale bar=100 μm)

2.3 半相合細胞移植改變腫瘤部位的免疫微環境

HE染色結果顯示(圖3)，移植2周時，與環磷酰胺組和對照組相比，移植組小鼠腫瘤組織浸潤淋巴細胞數增多。與對照組相比，環磷酰胺組腫瘤相關因子含量差異均無統計學意義(P均>0.05)；與對照組和環磷酰胺組相比，移植組腫瘤組織中IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α含量明顯增高(P均<0.05)，IL-4和TGF-β 含量明顯降低(P均<0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠腫瘤組織HE染色(scale bar=100 μm)

2.4 供體來源的淋巴細胞參與GVT反應

與移植3 d時相比，移植2、4周時移植組CB6F1小鼠外周血中H-2Kb所占比例顯著增加(P均<0.01)。見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測移植組小鼠不同時間點外周血嵌合率

3 討論

產生GVT和GVHD的主要原因是白細胞抗原不匹配[11]。因此本研究采用皮下種植CT-26結腸癌細胞的小鼠作為研究模型，采用骨髓細胞和脾細胞靜脈注射非清髓治療的方法，結果顯示4周時移植組結直腸腫瘤體積顯著小于環磷酰胺組，由此表明，先注射環磷酰胺降低小鼠免疫力，再進行半相合細胞移植具有明顯的、長期的移植物抗結直腸癌效應。研究表明，GVHD反應與小鼠肝、小腸和皮膚組織有關[12-13]。本研究HE染色結果顯示，移植組中GVHD反應顯著改善，由此表明免疫原性降低的半相合細胞移植對結直腸癌的治療效果良好。

免疫環境由腫瘤白細胞的浸潤程度、功能狀態和組織所決定，可反映患者預后、治療反應預測等相關信息[14-15]。本研究結果顯示，移植組小鼠移植后2周腫瘤浸潤淋巴細胞數顯著增加，提示半相合細胞移植可以重塑腫瘤微環境。研究表明，IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α和TGF-β細胞因子含量與腫瘤微環境相關[15]。 IFN-γ和IL-2屬于Th1型細胞因子，可促進T細胞介導的免疫反應，促進NK細胞和巨噬細胞活化，發揮抗腫瘤作用[16]。IL-4和IL-10屬于Th2型細胞因子，可調節肥大細胞或嗜酸性粒細胞介導的免疫應答。TNF-α是由免疫細胞分泌的具有抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤退行性變化的細胞因子[17]。本研究結果顯示，與環磷酰胺組相比，移植組IL-2、IL-10、IFN-γ與TNF-α細胞因子含量顯著升高，IL-4和TGF-β表達水平明顯降低，由此表明移植組小鼠腫瘤免疫微環境得到改善，半相合細胞移植可增強腫瘤的免疫應答。研究表明，供者細胞比例越高，移植物抗腫瘤效應越強[18-19]。本研究結果顯示，移植后2、4周移植組小鼠H-2Kb 所占比例較3 d時顯著增加 ，表明半相合細胞供者來源的骨髓細胞和淋巴細胞參與GVT效應。

綜上所述，半相合細胞移植后靜脈注射環磷酰胺可誘導長期免疫耐受，降低GVHD反應的同時改善了抗結腸癌的作用時間和強度，但具體機制有待進一步研究。