超聲輔助提取金花茶葉多酚的工藝優化及其抗氧化活性研究

陳鐵楊，胡文忠，侯夢陽，陳雁，王佳宇，閆麗娜

（1.大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024）

金花茶[Camellia petelotii（Merrill）Sealy]，為山茶科山茶屬植物，主要分布于廣西防城港市，為國家一級保護植物，是一種具有開發利用價值的特有珍稀植物資源，具有獨特的觀賞價值、經濟價值和藥用價值[1-3]。金花茶含有多酚、多糖、總皂苷等成分以及鍺、鋅、硒等能夠維持機體健康的微量元素。研究表明，金花茶花朵具有抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化、降血脂和保護心腦血管等作用[4-7]。金花茶葉片用作茶飲，可起到清熱解毒、利咽止痛、利尿消腫和增強體質等保健功效[8-9]。近年來金花茶被逐漸應用于食品、化妝品等功能性健康產品的開發，但是金花茶葉并未得到科學合理的開發利用。

植物多酚是植物體內的次級代謝產物，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌和增強免疫力等多種生物活性，已廣泛應用于食品、保健、生物醫藥等領域[10-11]。酚類物質的傳統提取方法包括熱水浸提法、回流提取法等，但是存在提取效率不高、提取時間長和步驟復雜等問題[12-13]。超聲波輔助法的提取效果較為理想，可以大大縮短提取時間、提高提取效率、降低成本消耗和保護天然活性成分功效，是一種常應用于天然產物活性成分領域的提取方法[14-16]。

目前針對金花茶葉多酚的提取工藝研究未見報道，本研究采用超聲波輔助法提取金花茶葉多酚，并通過正交試驗對金花茶葉多酚的提取工藝進行優化，同時對金花茶葉多酚提取物的體外抗氧化活性進行評價，以期為金花茶葉多酚的開發利用提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金花茶葉：采摘于廣西防城港市；沒食子酸（標準品）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯氨-二-（3-乙基-苯并噻-6-磺酸）二胺鹽[2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）]、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）：上海源葉科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉（均為分析純）：天津科密歐試劑有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒：蘇州科銘有限公司；福林酚試劑（均為分析純）：北京索萊寶有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-250電熱恒溫干燥箱：杰瑞爾電器公司；DW-160中藥粉碎機：永康市鉑歐五金有限公司；FA1204B分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-320E超聲波清洗器：昆山超聲儀器公司；SHZ-Ⅱ循環水式多用真空泵：河南艾瑞德設備公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器公司；Multiskan GO酶標儀：美國THERMO SCIENTFIC公司；RE-201D旋轉蒸發儀：上海亞榮儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金花茶葉多酚的制備

將新鮮采摘的金花茶葉洗凈，在60℃下烘干，粉碎，過60目篩后裝入密封袋中，避光保存，備用。準確稱取1.0 g粉末，按預定的乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間在超聲波清洗器中進行多酚提取（固定功率為100 W，固定頻率為40 kHz），合并提取液，過濾，得到金花茶葉多酚提取溶液。

1.3.2 金花茶葉多酚含量的測定

沒食子酸標準曲線的建立參考Hao等[17]的報道，并略加修改。首先配制40 μg/mL～120 μg/mL沒食子酸工作液，分別吸取0.25 mL不同濃度的沒食子酸工作液于試管內，向試管內加入1.25 mL的福林酚試劑（用去離子水稀釋10倍），搖勻。25℃避光反應3 min，接著加入1.0 mL的7.5%碳酸鈉溶液，在45℃水浴鍋中加熱60 min，于765 nm處下測定吸光度，得線性回歸方程為 y=0.092 1x+0.197 9（R2=0.999 6）。

金花茶葉多酚提取量計算公式如下。

式中：C 為多酚質量濃度，mg/mL；V 為體積，mL；n為稀釋倍數；W為樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

準確稱取1.0 g金花茶葉粉末，采用超聲輔助法進行多酚提取，考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（10、20、30、40、50、60 min）、提取溫度（25、35、45、55、65、75 ℃）和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]對金花茶葉多酚提取量的影響。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比對金花茶葉多酚提取量的影響，相應因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 抗氧化活性試驗

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Hou等[18]測定方法并略加修改。現配濃度為0.5 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液，備用。分別吸取240 μL不同濃度樣品溶液，加入60 μL DPPH-無水乙醇溶液，搖勻，于酶標儀25℃孵育30 min，在517 nm處測定樣品溶液吸光度A1。按照相同方法，吸取樣品溶液和無水乙醇，測定吸光度A2；吸取無水乙醇和DPPH溶液，測定吸光度A0。以Trolox溶液作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考Shen等[19]測定方法并略加修改。使用蒸餾水配制50 mL 7 mmol/L ABTS和50 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，混勻，室溫下避光反應16 h，得到ABTS母液。蒸餾水稀釋ABTS工作液，使其在734 nm處吸光值穩定在0.7±0.02范圍內，即制備得到ABTS工作液。

分別吸取50μL不同濃度的樣品溶液，加入200μL ABTS工作液，搖勻，于酶標儀37℃孵育10 min，在734 nm處測定吸光度A1。按照相同方法，吸取樣品溶液和蒸餾水，測定吸光度A2；吸取蒸餾水和ABTS工作液，測定吸光度A0。以Trolox溶液作為陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.3 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力采用總抗氧化能力檢測試劑盒進行測定。

1.4 數據處理

每組試驗重復3次，試驗結果使用Excel 2010、SPSS 19.0、Origin 2018等軟件進行分析和圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響

乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖1可知，乙醇濃度40%～80%時，多酚提取量在不斷提高，而且呈現較快的增長速度，當乙醇濃度80%時，多酚提取量最高，達到167.50 mg/g，隨后下降。原因可能是乙醇濃度過高時，多酚與溶劑的極性相差很大，蛋白質變性沉淀，同時會有大量脂溶性、醇溶性物質溶解，導致酚類化合物的溶解度降低[20-22]。因此，選擇最佳乙醇濃度為80%進行后續試驗。

2.1.2 提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響

提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響見圖2。

圖2 提取時間對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖2可知，提取時間由10min增加至30min時，多酚提取量在不斷提高，當提取時間為30 min時，多酚提取量最高，達到205.70 mg/g，繼續延長提取時間，提取量呈下降趨勢。原因可能是在一定的提取時間內，隨著提取時間的延長，多酚會通過超聲波空化效應和機械效應不斷溶出。提取時間過長時，會使多酚被逐漸分解和多糖、皂苷等雜質溶出，導致多酚提取量下降[23-25]。因此，選擇最佳提取時間為30 min進行后續試驗。

2.1.3 提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響

提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

由圖3可知，提取溫度由25℃升高至35℃時，多酚提取量不斷提高，當提取溫度達到35℃時，多酚提取量最高，達到214.74 mg/g，隨后開始明顯下降。原因可能是金花茶葉對于溫度特別敏感，隨著體系溫度升高，會提高分子的擴散能力，加大分子的運動速率，加速多酚的溶出，提高多酚提取量。當提取溫度繼續升高時，超聲波熱效應會使多酚結構被破壞和其他雜質溶出，多酚物質無法繼續溶出，而且酚類結構對高溫比較敏感，最終導致多酚提取量下降[26-28]。因此，選擇最佳提取溫度為35℃進行后續試驗。

2.1.4 料液比對金花茶葉多酚提取量的影響

料液比對金花茶葉多酚提取量的影響見圖4。

由圖 4 可知，料液比由 1∶10（g/mL）增加至 1∶50（g/mL）時，多酚提取量隨之提高，當料液比為1∶50（g/mL）時，提取量達到最高，為281.33 mg/g，隨后開始下降。原因可能是料液比過小時，提取溶劑與樣品接觸不完全因而提取量很低，不斷增加料液比后，多酚物質會逐漸溶出。但是繼續增加料液比，其他雜質溶出量會增加，而且增加濃縮多酚的時間，造成資源浪費和成本增加[29-31]。因此，選擇最佳料液比為 1∶50（g/mL）進行后續試驗。

圖4 料液比對金花茶葉多酚提取量的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of polyphenols from Camellia petelotii leaves

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，影響提取量的主次順序為A（乙醇濃度）>D（料液比）>C（提取溫度）>B（提取時間），結果表明乙醇濃度是最顯著的影響因素，提取時間對金花茶葉多酚提取量影響較小。正交試驗優化金花茶葉多酚提取量的最佳提取工藝參數組合為A3B2C2D2，即乙醇濃度90%、提取時間30 min、提取溫度35℃、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下進行驗證試驗，重復3組試驗，得到金花茶葉多酚提取量為295.82 mg/g。

2.3 抗氧化活性測定結果

2.3.1 金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響

金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響見圖5。

圖5 金花茶葉多酚對DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of Camellia petelotii leaves polyphenols on the scavenging ability of DPPH free radicals

由圖5可知，在15 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內，金花茶葉多酚和Trolox溶液對DPPH自由基具有一定的清除能力，并且清除率隨濃度的增加而提高，金花茶葉多酚清除率從25.98%上升至92.27%，呈現出良好的線性關系。Trolox清除率基本保持在96.25%，隨著質量濃度的增加，金花茶葉多酚的清除率逐步接近Trolox溶液，卻略低于Trolox溶液清除率，其IC50值為0.030 9 mg/mL，表明Trolox溶液的DPPH自由基清除能力高于金花茶葉多酚。

2.3.2 金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響

金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響見圖6。

圖6 金花茶葉多酚對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of Camellia petelotii leaves polyphenols on the scavenging ability of ABTS+free radicals

由圖6可知，在15 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內，金花茶葉多酚和Trolox溶液對ABTS+自由基均具有較好的清除能力，清除率隨濃度的增加而增強，金花茶葉多酚清除率從23.04%升高至78.85%，濃度和清除率呈現正相關線性關系，但是明顯低于Trolox溶液的清除率，其IC50值為0.043 4 mg/mL。

2.3.3 金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響

金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響見圖7。

圖7 金花茶葉多酚對總抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of Camellia petelotii leaves polyphenols on total antioxidant capacity

由圖7可知，在0.4 mg/mL～2.4 mg/mL濃度范圍內，多酚提取物總抗氧化能力隨著樣品濃度的增加而增強，濃度與總抗氧化能力表現出正相關性，并不斷接近Trolox溶液的總抗氧化能力，但一直低于Trolox溶液的總抗氧化能力。金花茶葉多酚提取物濃度為2.4 mg/mL時，其總抗氧化能力為0.82 mmol/L，表明其具有較好的總抗氧化能力。

3 結論

本試驗通過正交試驗優化得到金花茶葉多酚最佳提取工藝條件為乙醇濃度90%，提取時間30 min，提取溫度35℃，料液比1∶50（g/mL），在此條件下多酚提取量達295.82 mg/g。DPPH、ABTS+自由基清除能力及總抗氧化能力試驗結果表明，金花茶葉多酚提取物具有一定的抗氧化能力，其IC50值分別為0.030 9、0.043 4 mg/mL，總抗氧化能力為0.82 mmol/L。本試驗可為進一步提高金花茶葉資源的有效開發利用提供科學依據。