結直腸癌外周血循環腫瘤細胞研究進展*

羅善山

2016 年，我國結直腸癌發病率為17.4/105，位于惡性腫瘤排行榜中第2 位，死亡率為7.9/105[1]，其惡性程度高、復發轉移率高、危害大。我國結直腸癌患者僅約11%診斷為早期，大部分患者就診時，已經出現腫瘤遠處轉移[2]。腫瘤轉移是一個涉及多步驟、多因素的復雜過程，具有轉移潛能的腫瘤細胞脫離原發病灶，以極少的數量轉移到血液、骨髓、淋巴結或遠處器官中，運用常規病理檢測手段（非免疫組化和分子生物學技術等）難以發現，這種現象稱為腫瘤的微轉移[3]。腫瘤轉移的最初階段，腫瘤細胞脫落、遷移、侵襲并進入血液循環，為最終形成可被影像學檢測的腫瘤轉移病灶提供了基礎與條件。研究發現，外周血循環腫瘤細胞（CTCs）伴隨著腫瘤發展過程并攜帶了其分子生物信息[4]。因此，隨著生物技術等方面的發展，CTCs 檢測及其與腫瘤的相關性逐漸成為臨床研究的熱點。本文就結直腸癌外周血CTCs 檢測、臨床意義方面進行綜述。

1 CTCs概述

在1869 年，澳大利亞病理學家Ashworth 發現血液中存在一種特別的細胞，和尸檢發現的腫瘤細胞相似，首次提出并報道了CTCs[5]。目前CTCs 的定義為：自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。進入循環未被清除的腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發展為轉移灶[6]。CTCs 是上皮組織來源的癌細胞，經過上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）后，具有了遷移和侵襲血管的能力，研究認為其是導致體內腫瘤轉移的主要原因[7-8]；大多數CTCs 受機體微環境影響而發生凋亡，一部分到達適宜的生態部位后，會發生EMT，重新獲得腫瘤干細胞特性，并就此固定形成新的轉移病灶[9]。區別于腫瘤標志物，CTCs 是具有腫瘤學生物活性的腫瘤細胞，其攜帶了腫瘤的所有分子生物學信息，在動態的監測下，可直接地反映腫瘤在各個階段連續變化過程[8]。越來越多研究深入到腫瘤轉移機制，以及生物醫學檢測技術的巨大進步，CTCs 的檢測已有較大進展，這些檢測系統在可重復性、敏感性、特異性和成本控制等許多方面已取得較為理想結果，其中較為成熟應用廣泛富集技術，可從血液樣本中富集CTCs，以及細胞計數、表型分析和單細胞分析等各種檢測，有助于發現提前或早期腫瘤、預測預后、選擇化療和靶向治療。

2 CTCs的檢測

目前CTCs 的檢測呈現手段多樣化，敏感性和特異性高效的檢測系統可分兩大類：基于免疫親和富集法和基于生物物理特性富集法。

2.1 基于免疫親和富集法 基于免疫親和富集法應用比較廣泛，其中應用最多的是免疫磁分離方法，其中有正富集為上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和負富集基于CD45。EpCAM 是陽性富集技術中使用的標志物典型代表，具有上皮特異性，并且在大多數腫瘤中高度表達。近年來，研究者開發出許多基于EpCAM 的CTCs富集技術。其中，CellSearch 系統是第一個，也是唯一項通過美國FDA 批準用于臨床的CTCs 檢測技術。其原理是采用一種涂有EpCAM 且可同鐵微粒相結合的抗體，稱為鐵磁流體，這種鐵磁流體和CTCs 中EpCAM 有極強的特異性結合能力，結合后使用強力磁體將這些CTCs 從樣本中提取出，然后使用基于4’，6-二氨基-2-苯基吲哚細胞核染色，CD45 別藻藍蛋白特異性白細胞陰性選擇和細胞角蛋白8，18，19-藻紅蛋白特異性上皮細胞陽性選擇來識別細胞，以此來計數CTCs。Balic 等[9]分別使用CellSearch 系統和OncoQuick 法檢測外周血中CTCs，結果顯示，OncoQuick 系統中61 例患者中14 例（23%）和CellSearch 系統中33 例（54%）中檢測到至少一種CTCs（P<0.000 1），CellSearch檢測出CTC 數量（平均20 個/7.5 mL 血液）大于OncoQuick（3 個/7.5 mL；P<0.000 1），結論認為，使用CellSearch 系統檢測CTCs 更準確、更靈敏。CellSearch 系統是目前自動化程度最高的CTCs 檢測技術，受人為因素影響較小，具有較高的特異性、敏感性及可重復性，但由于缺乏腫瘤特異性抗原，敏感度相對較低，會出現漏診，且檢驗費用較高，使其在臨床上的廣泛應用受到一定限制。

尋找出CTCs 特異性分子標志物，是提高CTCs檢測的有效方法。腫瘤生長速度遠快于機體正常組織，快速分裂的腫瘤細胞表面過度表達葉酸受體（FRs），以此來吸收葉酸（FA），促進DNA 和RNA的生物合成。Zhu 等[10]使腫瘤靶向分子FA 和磁性納米顆粒分別通過疏水相互作用和化學共軛作用涂覆在紅細胞表面，后者粘附到CTCs 上，并且在磁場中分離獲得的CTC-RBC 綴合物，離心后CTCs 捕獲并計數。結果顯示，捕獲效率在90%以上，純度高于75%。在相同條件下，遠高于基于EpCAM 的免疫磁分離技術（捕獲效率為80%，純度為20%）。即使是特異性的分子標志物，也面臨配體表達水平異質性不足的問題，利用抗體之間的協同作用可以提高CTC 檢測技術的靈敏度，如使用在非小細胞肺癌中基于EGFR/HER3 的富集法[11]。

2.2 基于生物物理特性富集法 基于生物物理特性的富集技術，主要利用CTCs 和血細胞在大小、變形能力、密度和電學特性方面差異，進行離心、微濾、微流體操控、電泳等方法進行分離和計數。這種無須抗體標記或特殊處理的分離CTCs 方法更適用下游分析[12]。其可以捕獲在各個階段包括稀有細胞表型在內的各種表型的CTCs，有助于確定CTCs在指導治療和預測預后。基于細胞大小的分離技術，主要是利用CTCs（大小為10～20 μm，變形性差）和血細胞（紅細胞8 μm；白細胞7～12 μm；可變形性好）之間的差異性，選擇合適的閾值進行分離。Oh 等[13]使用高密度微孔芯片過濾器富集76 例結直腸癌患者和20 例健康對照受試者CTCs，結果顯示，50 例患者（陽性率為65.8%）檢測到CTCs，陽性患者與高水平癌胚抗原表達和晚期癌癥明顯相關（P=0.038、0.017）。Ⅳ期患者CTCs 計數（12.47±24.00）顯著高于Ⅰ～Ⅲ期（2.84±5.29）（P=0.005）和健康對照組（0.25±0.55）（P<0.001），結論認為這種基于細胞大小的新檢測平臺可預測結直腸癌患者預后。CTCs 的密度介于血漿和紅細胞之間，但在白細胞密度范圍內。利用密度介質的差異沉降系數和基于密度的梯度進行離心，使不同密度的細胞在分離液中實現分層分布，實現CTC 的分離。Campton 等[14]利用CTC 的特定密度，使用獨特基于密度的分離裝置將有核細胞從血液中分離，將白細胞和血小板的血沉棕黃層完全分離，移位到顯微鏡載玻片染色，使用顯微鏡對載玻片進行成像，結果顯示，懸浮腫瘤細胞的回收率為90.5%～91%。雖然該系統的CTC 計數能力優于 CellSearch，但由于白細胞和CTCs 之間存在一些物理性質的重疊，導致特異性差和部分CTCs 丟失。

綜上所述，基于免疫親和力或生物物理特性的CTCs 富集技術存在一定的優勢和局限性，集成微流控裝置的出現很好地結合了兩者的優點，提高了檢測的靈敏度和特異性。Jiang 等[15]通過確定性橫向位移（DLD）隔離結構、帶有CD45 標記的免疫磁珠的自動純化裝置和涂有鼠尾膠原蛋白的捕獲平臺，組合成的一個集成微流體裝置，通過從血液中捕獲綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞，在轉移性腫瘤患者捕獲CTCs 陽性捕獲率為83.3%。該裝置與CellSearch 系統同時進行檢測30 例腫瘤患者比較，結果顯示，兩種方法的捕獲效率之間沒有顯著差異。然而，集成微流控裝置在時間、樣本量和分析成本方面顯示出優勢。

3 CTCs在結直腸癌中的臨床意義

研究顯示，在結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中通過檢測，均發現了CTCs[16]。通過研究CTCs 在腫瘤病情發展過程中的變化，可能可為篩查、預后判斷、病情評估及治療反應等方面提供預測信息。有關CellSearch 系統檢測結直癌患者外周血CTCs 的臨床研究，國內外已有報道。Yang等[17]通過基于免疫親和負分離富集法檢測良性結直腸病（結直腸息肉）和非轉移性結直腸癌患者術前CTCs 發現，結直腸癌患者CTCs 計數顯著高于結直腸息肉患者（3.47±0.32）個/3.2 mL vs（1.49±0.2）個/3.2 mL（P<0.001）。Tsai 等[18]通過檢測健康對照受試者、結直腸腺瘤和結直腸癌患者外周血CTCs，結果顯示，CTC 計數與惡化的疾病狀態緊密相關（P<0.000 1），在95%結直腸癌分期和79%腺瘤性病變中顯示出高度特異性（86%）和高度敏感性。與臨床常用檢查方法包括腸鏡檢查等比較，CTCs 檢測有著更好的依從性，但是結腸鏡檢查和活檢仍是診斷的金標準，篩查發現CTC陽性，可進一步進行內鏡檢查和活檢確診。研究發現CTCs 與胃癌、小細胞肺癌、淋巴結陽性的黑色素瘤、晚期胰腺癌臨床病理參數及預后密切相關[19-22]。Sastre 等[23]通過使用CellSearch系統檢測1 202 例結直腸癌外周血CTCs 表達，結果顯示，CTCs ≥3 個/7.5 mL 組與不良的預后因素（較差的ECOG 評分、Ⅳ期、3 個以上部位轉移、癌胚抗原水平升高）具有相關性。Huang 等[24]通過Meta 分析使用CellSearch 系統檢測11 項研究1 847 例結直腸癌患者的外周血CTCs，CTCs>5 個/7.5 mL 為陽性值，結果顯示，轉移性結直腸癌組CTC 陽性率顯著高于無轉移組[OR=4.06，95%CI（1.74，9.50），P<0.01，I2=0%]，CTCs 陽性率與結直腸癌的總生存 率[HR=2.00，95%CI（1.49，2.69），P<0.01，I2=67.1%]和無進展生存時間[HR=1.80，95%CI（1.5，2.13），P<0.01，I2=43.9%]明顯相關。Krebs 等[25]使用CellSearch 系統檢測48 例使用高強度化療方案卡培他濱、奧沙利鉑+/-伊立替康聯合貝伐單抗+/-西妥昔單抗治療結直腸癌病例的外周血CTCs，結果顯示，CTCs ≥3 個/7.5 mL 和CTCs<3 個/7.5 mL患者平均總生存時間分別為18.7 個月和22.3 個月（P=0.038），結論認為，通過CTCs 計數分層可以篩選出可能從強化治療方案中受益的患者，避免低CTCs 組使用高毒性方案。同樣地，Aranda等[26]分析349 例使用卡培他濱和奧沙利鉑+/-伊立替康聯合貝伐單抗一線治療轉移性結直腸癌外周血CTCs ≥3 個/7.5 mL 病例，結果顯示，卡培他濱、奧沙利鉑和伊立替康聯合貝伐單抗組患者和卡培他濱和奧沙利鉑聯合貝伐單抗中位無進展生存時間分別為12.4 個月[95%CI（11.2，4.0）]和9.3 個月[95%CI（8.5，10.7）]，HR=0.64[95%CI（0.49，0.82），P=0.000 6]，結論認為，通過CTCs 計數分層可以有助于高強度化療方案的選擇。Yang 等[27]通過動態監測138 例結直腸癌根治術患者的CTCs，結果顯示，術前和術后CTCs 陽性患者3 年復發率（53.8%）比術前CTCs 陽性但術后陰性患者（78.9%）低25.1%（P=0.004），結論認為術后CTCs 陽性根治性術患者是復發的獨立預后危險因素。動態監測CTCs 可用于評估指導風險調整和個體化診治。Tan等[28]使用基于細胞大小的生物物理特性富集法在化療過程中動態轉移性結直腸癌患者外周血CTCs，CTC 計數趨勢與影像學測量定義的疾病進展和癌胚抗原（CEA）水平趨勢呈正相關，并且CTCs 的變化更為敏感，提示可用于監測治療期間對化療和疾病進展/緩解的反應。

結直腸癌惡性程度高、異質性大、復發轉移率高。不同患者對治療的反應及預后相差巨大，使用單一的預測因子難以評估全部的治療效果和預后。盡管CTC 檢測作為結直腸癌判斷預后和治療選擇有用標志物已引起廣泛關注，由于缺乏用于評估癌癥預后和進展的統一標準和臨界值，仍難入進入廣泛的臨床應用。外周血CTCs 是否比傳統的影像學等更早地準確預測腫瘤的進展或緩解？諸如此類問題還需要更多的研究揭示。