結腸癌轉(zhuǎn)移相關基因1、分離酶抑制蛋白在乳腺癌進展中的作用

王 麗，郭宏艷，何利珍 ，張云霏，張 虹，聶登梅

(1.西北民族大學附屬醫(yī)院,甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

近年來隨著國內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率的不斷上升，乳腺癌已取代肺癌，成為全球第一大癌，嚴重威脅著女性的健康，而且，關于進展期乳腺癌的侵襲性和治療的研究一直以來都是研究的熱點。結腸癌轉(zhuǎn)移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)是一個與結腸癌密切相關的基因，也是肝細胞生長因子(HGF)/c-Met信號轉(zhuǎn)導通路的重要調(diào)節(jié)因子[1]；分離酶抑制蛋白(Securin)通過抑制分離酶的活化，從而抑制染色體的過早分離，Securin的過表達可導致細胞的非整倍性，進而引起體內(nèi)基因轉(zhuǎn)化和體外腫瘤形成[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)MACC1和Securin在消化道癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達[3，4]，發(fā)現(xiàn)MACC1和Securin與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移具有相關性，但是兩者在乳腺癌中的研究卻相對缺乏，本研究檢測乳腺浸潤性導管癌不同病變組織中MACC1和Securin的表達情況，并探究二者在乳腺癌中的表達有無相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集甘肅省第二人民醫(yī)院病理科2015年1月至2020年6月乳腺活檢及乳腺癌根治手術標本，均為女性患者，年齡25～78歲，中位47歲。納入標準：術前均未接受化療、放療及其它輔助治療。排除標準：術前曾接受放化療或其他腫瘤的針對性治療者，并患有其他系統(tǒng)嚴重疾病者。其中乳腺導管普通增生(usual ductal hyperplasia，UDH)20例、導管異型增生(atypical ductal hyperplasia，ADH)20例、導管原位癌(ductal carcinama in situ，DCIS)15例、無淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導管癌26例、伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤性導管癌29例。其中20例UDH及20例ADH取自乳腺局部切除的標本，乳腺癌病例取自根治標本。所有患者術前均未接受化療、放療及其它輔助治療。由兩位副主任以上病理醫(yī)師對病理進行診斷、分類和分級。液氮冷凍組織用于mRNA檢測，石蠟包埋組織用于免疫組化檢測。

1.2 方法

1.2.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) Trizol法(Trizol試劑購自美國Invitrogen公司)提取各液氮冷凍乳腺組織總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(購自加拿大Formentas公司)說明書所述方法，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。MACCl基因的上游引物序列為5′-GCTTGGGCTCACTTCCACAA-3′，下游引物序列為5′-ACCACGAAGGGTGAAAGCAT-3′，擴增產(chǎn)物長度為201bp；Securin基因的上游引物序列為5′-GACTGTTCCGCTGTTTAGCTC-3′，下游引物序列為5′-GTGGGGCATCGAACGTTTTG-3′，擴增產(chǎn)物長度為295bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物序列為5′-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游引物序列為5′-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3′，擴增產(chǎn)物長度為313 bp，以上引物均由生工生物(上海)工程技術有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后，72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.2免疫組織化學 手術標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，4～6 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化。浸入檸檬酸鹽修復液中熱抗原修復3 min，自然冷卻至室溫，放入PBS緩沖液中震蕩并沖洗3次，3 min/次。滴加3% H2O2孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加10%正常山羊血清，室溫孵育10 min，消除非特異性染色。滴加一抗(1∶200 MACC1兔抗人多克隆抗體(購自美國Sigma公司)；Securin兔多克隆抗體(購自Santa Crue(USA)公司))4 ℃過夜，次日PBS沖洗3次，3 min/次。滴加聚合物輔助劑，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，3 min/次。滴加辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體(試劑購自福州邁新生物技術有限公司)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，3 min/次。DAB顯色(試劑購自福州邁新生物技術有限公司)，蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。以PBS緩沖液置換一抗作為陰性對照，用已知MACC1陽性的組織作為陽性對照。

1.3 結果判定MACC1蛋白產(chǎn)物主要表達于胞漿，少數(shù)可表達在細胞核，胞漿或胞核染色呈黃色或棕褐色者視為陽性細胞； Securin蛋白產(chǎn)物主要表達于胞漿，胞漿染色呈黃色或棕褐色者視為陽性細胞，根據(jù)陽性范圍和陽性強度綜合分析。陽性細胞數(shù)<5%記為0分，5%～30%記為1分；30%～60%記為2分；≥60%記為3分。無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項評分結果相加后分為4級：0～1分為陰性(-)；2分為弱陽性(+)；3～4分為中度陽性(++)；5～6分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同乳腺組織中MACC1與Securin蛋白的表達情況MACC1蛋白主要表達于乳腺癌的癌細胞，定位于胞漿，但少數(shù)也可表達在細胞核，而在乳腺增生組織中幾乎不表達(見圖1)，MACC1在UDH、ADH、DCIS、IDC陽性表達率分別為0%、0%、13.33%、81.82%；Securin蛋白主要表達于乳腺癌的癌細胞，定位于胞漿，而在乳腺增生組織中幾乎不表達(見圖2)。

圖1 不同乳腺組織中macc1的表達 (免疫組化envision兩步法) a： udh組織中陰性表達(×100)；b: dcis組織中弱陽性表達(×200)；c: idc淋巴結轉(zhuǎn)移陽性組織中強陽性(2+)表達(×200)；d: idc淋巴結轉(zhuǎn)移陽性組織中強陽性(3+)表達(×200)

圖2 不同乳腺組織中Securin的表達(免疫組化染色EnVision兩步法) a：UDH組織中陰性表達(×100)；b: DCIS組織中弱陽性表達(×200)；c: IDC淋巴結轉(zhuǎn)移陽性組織中強陽性表達(×200)

2.2 不同臨床病理參數(shù)中MACC1與Securin蛋白的表達比較不同腫瘤的直徑、組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移、乳腺組織類型中MACC1與Securin蛋白的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)中MACC1與Securin蛋白的表達比較 (n)

2.3 不同乳腺組織中MACC1 mRNA、Securin mRNA的表達情況MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺組織中的表達比較，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。其中MACC1 mRNA、Securin mRNA分別在乳腺增生組與癌組中的表達(χ2=45.414，48.894)；在原位癌組與浸潤癌組中的表達(χ2=105.803，111.892)、淋巴結轉(zhuǎn)移陰性組與陽性組中的表達比較(χ2=98.868，109.247)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。RT-PCR檢測MACC1 mRNA、Securin mRNA在不同乳腺組織中的表達情況見圖3。

表3 不同乳腺組織中MACC-1 mRNA、Securin mRNA的表達情況 [n(%)]

2.4 乳腺癌組織中MACC1 與Securin的相關性分析在70例乳腺癌組織中MACC1和Securin的表達相關(r=0.785；r=0.642，均P<0.001)，見表4、表5。

表4 Securin mRNA與MACC1 mRNA的相關性

表5 MACC1蛋白與Securin蛋白表達的相關性

3 討論

乳腺癌已成為嚴重危害女性健康的“頭號殺手”，其發(fā)病率和死亡率均高居首位。雖然目前已有手術切除、放療、化療、內(nèi)分泌治療及免疫治療等多種有效的治療手段使得乳腺癌患者的生存情況得到了極大的改善，但部分患者因復發(fā)、轉(zhuǎn)移，預后仍然較差。因此，與乳腺癌進展相關的分子基礎和信號途徑的研究對于該疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有著重要的指導性作用，即規(guī)范和精準地治療乳腺癌對提高患者的生存率意義重大。

研究表明，正常組織中HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導通路在胚胎發(fā)育和組織損傷修復中起重要作用[5]。此外，HGF/c-Met信號通路在細胞增殖、遷徙、血管生成、上皮細胞間質(zhì)化過程中也起重要作用, 但是它的異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生，特別是惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關[6]。據(jù)文獻報道MACC1可以在轉(zhuǎn)錄水平增強c-Met的表達，使HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導通路異常激活，從而促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[7]。張巍[8]的研究表明，MACC1可以增強腫瘤細胞的遷移能力，增加胃癌細胞淋巴結轉(zhuǎn)移和浸潤能力。此外，熊晶等[9]的研究表明，MACC1蛋白在乳腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且此蛋白的表達與乳腺癌患者組織學分級、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤復發(fā)顯著相關；MACC1高表達的患者總生存期和無進展生存期均較短；MACC1可能參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，在乳腺癌預后評估中具有一定的價值。本課題研究顯示，MACC1在乳腺增生組織中不表達或低表達，而在乳腺導管原位癌中及未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤癌中高表達，在淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達更高、更明顯，與以上研究結果相符。此外，本課題從乳腺增生組織到乳腺癌的病變進展組織中，可以看到MACC1不論是分子水平的mRNA表達還是免疫組化的蛋白表達均呈現(xiàn)出梯度遞增的表達狀態(tài)，從而提示MACC1在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起到了重要作用，因此推測MACC1對判斷乳腺癌的進展具有重要意義，且有可能成為潛在的靶點，為乳腺癌的治療提供一些新思路。

正常組織中Securin在睪丸與胸腺中表達水平較高，而在胎盤、結腸、小腸、大腦、胰腺中低水平表達。此外，Securin還參與了細胞的有絲分裂、凋亡以及DNA修復等關鍵的細胞活動[10]，在有絲分裂后期，Securin蛋白N末端的毀壞盒與后期促進復合物連接，并在多種酶類參與下被泛素化降解，從而使分離酶活化[2]。Securin的高表達可以誘導細胞的多倍體性，而Securin的缺失則可引起基因的不穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)，Securin的在多種內(nèi)分泌腺體及腺體相關惡性腫瘤中表達異常，如腦垂體瘤、甲狀腺癌、卵巢癌、結腸癌等，并且還與腫瘤的惡性程度相關[11]。然而Securin在乳腺癌中的研究相對較少，為了探索它在乳腺癌中的表達以及是否和乳腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲相關，我們在Selam等[12]研究基礎上，增加了導管原位癌組織樣本，相繼研究不同乳腺組織中Securin在分子及蛋白水平的表達情況，結果顯示，Securin在乳腺增生組織中不表達或低表達，在乳腺導管原位癌中及未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺浸潤癌中異常高表達，而在已發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中的表達更高、更明顯。因此Securin在乳腺癌的病變進展組織中無論是在分子水平還是蛋白水平都呈現(xiàn)出梯度遞增的表達狀態(tài)。此外，吳秋等[13]研究也顯示，Securin與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Gurvits等[14]研究表明，securin的表達可作為乳腺癌患者強有力且獨立的預后指標，尤其是對在生物學和臨床上具有挑戰(zhàn)性的三陰性乳腺癌。因此，基于以上研究結果我們推測Securin也有可能是一種潛在的預測乳腺癌進展的新型標記物。

綜上所述，MACC1與Securin雖非同一通路、同一作用機制的相關因子，但是在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，本研究發(fā)現(xiàn)MACC1與Securin蛋白的表達在不同腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移之間的表達差異具有統(tǒng)計學意義，且MACC1與Securin在乳腺癌中基因及蛋白水平的表達相關。因此，在乳腺癌組織中聯(lián)合檢測MACC1與Securin的表達情況，可以給我們提供重要的預測信號，了解乳腺癌患者疾病的進展情況，也有望為乳腺癌的分子靶向治療提供新的靶點。