基于棕櫚仁油的特醫脂肪乳液制備及其對小鼠血脂的影響

朱海華，葛瑞宏，馬銀輝，楊峻豪，王 永，王 慧?

（1. 河南省商業科學研究所有限責任公司，河南 鄭州 450002；2. 上海交通大學醫學院 公共衛生學院，上海 200025；3. 馬來西亞棕櫚油總署 大馬棕櫚油技術研發（上海）有限公司，上海 201108；4. 上海海洋大學 食品學院，上海 201306）

營養物質是一切生命的物質基礎，營養支持對于臨床治療具有重要意義，能夠幫助患者改善營養狀態、糾正代謝失衡[1]、減少感染等并發癥[2-4]、促進康復，同時能夠縮短住院時間、降低再住院率[5]和死亡風險[6]，從而減少醫療費用等[7-8]。特殊醫學用途配方食品（Food for Special Medical Purpose，簡稱 FSMP）是臨床病人營養支持的重要工具之一[9]，它是為了滿足進食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態人群對營養素或膳食的特殊需要，專門加工配制而成的配方食品，必須在醫生或臨床營養師的指導下單獨食用或與普通食品及其它特殊膳食食品共同使用，包括全營養配方食品、特定全營養配方食品和非全營養配方食品三大類，非全營養配方食品主要有脂肪、蛋白質及碳水化合物等營養素組件以及電解質、流質配方等[10]。目前市售特醫脂肪組件產品以紅花油、菜籽油等為原料制備，在脂肪酸均衡組成方面還有待進一步優化。

中鏈甘油三酯（Medium chain triglycerides，MCTs）是指含8～12個碳原子的中鏈脂肪[11]，天然存在于棕櫚仁油、椰子油等食物和母乳中[12]，是膳食脂肪的來源之一，與長鏈脂肪酸甘油酯相比，MCTs分子量小，水解速度快，更易被人體消化、吸收和代謝[13]。棕櫚仁油（Palm kernel oil，PKO），由棕櫚仁經壓榨提煉而成，富含中碳鏈月桂酸和肉豆蔻酸，其中月桂脂肪酸（C12∶0）占棕櫚仁油脂肪酸組成的44%[14]，是中鏈甘油三酯的天然食物來源，化學性質穩定，不易發生過氧化反應。目前有關棕櫚仁油在特醫食品中的應用研究較少，因此，具有一定的研究意義及開發潛力。

目前，FSMP產品形態以粉劑和液體為主，粉劑產品約占 40.4%，液體產品約占 49.6%[15]。液體FSMP產品使用前無需進行復水操作，較粉劑使用更方便，是FSMP的常用劑型[16]。本文參照《特殊醫學用途配方食品通則》、FSMP研發要求以及特醫乳液產品質量標準等相關要求[17]，開發基于棕櫚仁油的特醫脂肪乳液產品，進行穩定性評價，并通過動物試驗評價其對血清血脂的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棕櫚仁油、紅花籽油、亞麻籽油、葵花籽油、低芥酸菜籽油：市售；中鏈甘油三酯（MCTs oil）（藥品級）、總膽固醇（TC）檢測試劑盒：上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂、黃原膠（藥品級）：國藥試劑（上海）有限公司；Microlipid脂肪乳液：美國雀巢公司；脂肪酸甲酯標準品：上海安譜實驗科技股份有限公司；甘油三酯（TG）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；小鼠低密度脂蛋白（LDL）ELISA試劑盒、小鼠高密度脂蛋白（HDL）ELISA試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司。

健康SPF級昆明小鼠（26±2）g 40只，雄性：北京維通利華實驗動物技術有限公司；動物維持飼料及低脂飼料：江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司，飼料生產許可證：蘇飼證2019（01008）。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計、HE53/02 鹵素水分測定儀、AB135-S電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NanoZS90馬爾文納米粒度分析儀：英國馬爾文公司；Multiskan Spextrum酶標儀、Multifuge XR 1高速冷凍離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Eurostar 40 digital 數顯型懸臂攪拌器、T18高速勻漿機：德國IKA公司；高壓均質機：上海申鹿均質機有限公司；DV1粘度計：美國博勒飛公司；Agilent 7890B氣相色譜儀系統：安捷倫（美國）有限公司；Direct-Pure Genie10純水儀：上海樂楓生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油相的制備

按照設計配方比例將棕櫚仁油、紅花籽油、亞麻籽油、葵花籽油、低芥酸菜籽油等各種植物油與MCTs oil混合均勻作為油相。

1.3.2 特醫脂肪乳液制備工藝

由于卵磷脂分散在油相中的乳化效果優于其分散于水相中的乳化效果[18]，因此將大豆卵磷脂按比例添加至油相中，先用懸臂攪拌器在2 000 r/min條件下攪拌1 min中，讓乳化劑充分溶解在油相中，繼而逐漸加入水相進行乳化，最后將溶解在少量水中的黃原膠穩定劑添加至乳化體系中，充分混勻后置于高速勻漿機中在一定乳化速度、乳化溫度、乳化時間條件下進一步乳化得到初乳液。

初乳液經高壓均質機在一定壓力下均質數次，灌裝后再經高壓滅菌得到特醫脂肪乳液樣品，進行相關指標檢測及穩定性實驗。

1.3.3 乳化工藝條件優化

1.3.3.1 乳化速度 設置高速勻漿機乳化溫度30 ℃、乳化時間30 min，分別在乳化速度6 000、8 000、10 000、12 000及14 000 r/min的條件下進行乳化，考察不同乳化速度對脂肪乳液Zeta電位的影響。

1.3.3.2 乳化時間 設置高速勻漿機乳化速度10 000 r/min、乳化溫度30 ℃，分別在乳化時間10、20、30、40及50 min的條件下對進行乳化，考察不同乳化時間對脂肪乳液Zeta電位的影響。

1.3.3.3 乳化溫度 設置高速勻漿機乳化速度10 000 r/min、乳化時間30 min，分別在乳化溫度20、30、40、50、60及70 ℃的條件下進行乳化，考察不同乳化溫度對脂肪乳液Zeta電位的影響。

1.3.3.4 乳化工藝正交試驗 在單因素試驗結果的基礎上進行正交試驗，優化乳化工藝條件，正交因素水平表設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and coding level of experimental design

1.3.4 高壓均質條件確定

參考相關文獻[19-20]，使用高壓均質機分別在25 MPa和50 MPa條件下對前期乳化后的初乳液均質數次，根據測定的粒徑指標確定該特醫脂肪乳液的高壓均質條件。

1.3.5 高壓滅菌條件確定

參考相關文獻[16-18]，采用高壓滅菌方式對特醫脂肪乳液進行滅菌處理，考察溫度在121 ℃，時間分別為5、10、15、20 min條件下的滅菌效果。

1.3.6 穩定性試驗

按照優化工藝條件制備特醫脂肪乳液樣品，分別在溫度（4.0±2.0） ℃、（25.0±2.0） ℃、（40.0±2.0） ℃，濕度 RH 均為 60%±10%條件下放置一定時間后，考察產品的穩定性[21]。

1.3.7 脂肪酸組成的測定

采用GB5009.168—2016 對油相及特醫脂肪乳液樣品進行脂肪酸組成分析[22]。

1.3.8 粒徑測定

采用馬爾文納米粒度分析儀對脂肪乳液樣品進行粒徑測定，用去離子水作為分散介質將樣品稀釋100倍，混勻后取樣進行測定[23]，每個樣品平行測定3次。

1.3.9 Zeta電位測定

將脂肪乳液用去離子水稀釋100倍，采用馬爾文納米粒度分析儀測定乳液Zeta電位[24]，每個樣品測定重復3次。

1.3.10 動物試驗設計

選用8周齡SPF級雄性昆明小鼠40只，適應性喂養7 d后，標記并稱重，隨機分為五組，每組8只，依據中國營養學會發布的《中國居民膳食指南》(2016)，成人油脂推薦攝入量為25～30 g/d，同時參考中國居民實際油脂攝入量42 g/d[25]，運用營養代謝換算公式換算成小鼠的每日脂肪攝入量，設置低劑量組、中劑量組、高劑量組及商業樣品（Microlipid 脂肪乳液）對照組，同時設置空白對照組（普通維持飼料），如表2所示。試驗喂養30 d后稱重，眼球取血，采用試劑盒法進行血清總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）以及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）指標的測定。

表2 實驗動物每日脂肪攝入量及與成人每日脂肪攝入量對照Table 2 The daily fat intake of experimental animals compared with that of adults

1.4 數據分析

采用Excel 2010和GraphPad Prism 8.0軟件進行數據統計分析，所有試驗數據均采用平均值±標準偏差（SD）表示。

2 結果與分析

2.1 油相脂肪酸組成

以《特殊醫學用途配方食品通則》《中國居民膳食營養素參考攝入量》及相關醫學、營養學的研究結果為依據進行脂肪酸均衡型棕櫚仁油基脂肪乳液（PKO based fat emulsion for special medical purposes PKO-FESMP）產品配方設計?！吨袊用裆攀碃I養素參考攝入量》中建議[26]，居民每日膳食脂肪酸攝入推薦比例飽和脂肪酸（SFA）∶單不飽和脂肪酸（MUFA）∶多不飽和脂肪酸（PUFA）=1∶1∶1，PUFA 中，C18∶2（n-6）與C18∶3（n-3）的比值為（4～6）∶1。

特殊醫學用途配方食品的脂肪來源通常為混合精煉植物油，本文選擇棕櫚仁油、紅花籽油、亞麻籽油、葵花籽油、低芥酸菜籽油等各種精煉植物油以及MCTs oil，測定各原料脂肪酸組成，進行油相配方比例的設計，并通過測定油相脂肪酸組成進行驗證，結果如表3所示。

表3 棕櫚仁油基脂肪乳液油相脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition in formulated PKO-FSMP samples

試驗結果表明，該配方中油相SFA、MUFA、PUFA占比分別為32.09%±0.06%，33.84%±0.06%，33.99±0.09%，PUFA中n-6與n-3的比值約為5.16%±0.05，符合上述營養素參考攝入量推薦要求。

2.2 乳化工藝優化

特醫脂肪乳液通常為水包油型乳狀液[27]，乳化工藝是油脂乳狀液加工的關鍵技術。Zeta電位值的大小表示體系中相鄰帶電粒子之間的靜電斥力，從而抵抗粒子間相互吸引發生聚集，靜電穩定機制和空間位阻共同作用防止乳液體系中乳滴合并，因此是評價乳液穩定性的關鍵指標[28]。通常認為Zeta電位絕對值越高乳液越穩定，研究表明乳液的凈電位值大于 30 mV（即Zeta電位＞ ±30 mV）時能夠提供足夠的靜電斥力防止乳滴絮凝[29]，具有較好的物理穩定性[30]。本試驗以為高速勻漿機為乳化設備，納米粒度分析儀為檢測儀器，研究了乳化速率、乳化時間、乳化溫度等條件對乳化過程中Zeta電位值的影響，在單因素試驗基礎上開展正交試驗優化乳化工藝。

2.2.1 乳化速度對Zeta電位絕對值的影響

乳化速度對Zeta電位絕對值的影響如圖1所示，乳化速度從6 000 r/min增加到10 000 r/min， Zeta電位絕對值明顯增加。當乳化速度達到12 000 r/min時，Zeta電位絕對值達到最大值（35.50±1.77）mV，乳化速度繼續增大，Zeta電位絕對值略有下降。乳化速度為6 000 r/min和8 000 r/min時形成的Zeta電位絕對值均低于30 mV，表明脂肪乳粒徑較大，且乳化不均勻。乳化速度達到10 000 r/min以上時，Zeta電位絕對值均大于30 mV，表明乳化體系均勻、穩定性好，因此，確定乳化速度范圍為 10 000～14 000 r/min。

圖1 乳化速度對Zeta電位絕對值的影響Fig.1 Effect of emulsification speed on the absolute value of Zeta potential

2.2.2 乳化時間對Zeta電位絕對值的影響

乳化時間對Zeta電位絕對值的影響如圖2所示，除乳化時間10 min外，其他乳化時間的Zeta電位絕對值均高于30 mV。當乳化時間從10 min增加到30 min時，Zeta電位絕對值明顯增加，乳化時間達到30 min時，Zeta電位絕對值達到最大值（34.70±0.75） mV，乳化時間繼續增加，Zeta電位絕對值呈現下降趨勢，乳化時間從40 min增加到50 min，Zeta電位絕對值變化不大。因此，將乳化時間范圍確定為20～40 min。

圖2 乳化時間對Zeta電位絕對值的影響Fig.2 Effect of emulsification time on the absolute value of Zeta potential

2.2.3 乳化溫度對Zeta電位絕對值的影響

乳化溫度對Zeta電位絕對值的影響如圖3所示，在試驗乳化溫度條件下，Zeta電位絕對值呈現先升高后下降的趨勢。乳化溫度從 20 ℃上升到 40 ℃，Zeta電位絕對值明顯增加，乳化溫度為40 ℃時，Zeta電位絕對值達到最大值（36.63±1.49） mV，乳化溫度繼續升高，Zeta電位絕對值則開始降低，出現這一變化的原因可能是由于隨著乳化溫度的升高，乳化劑分子快速擴散到液滴界面，增加了液滴間的靜電排斥作用，Zeta電位絕對值增大；而隨著溫度繼續升高，一方面水相的粘度降低，布朗運動加劇，使液滴間碰撞合并的機率增大，同時由于乳化劑分子的熱運動增強，其從液滴界面逃離趨勢增加，導致液滴界面相同電荷減少，靜電斥力減弱，液滴間聚結增多，穩定性降低[31]。除了在乳化溫度20 ℃時Zeta電位絕對值為29.2 mV，其余乳化溫度下的Zeta電位絕對值均高于30 mV。因此，將乳化溫度范圍確定為30～50 ℃。

圖3 乳化溫度對Zeta電位絕對值的影響Fig.3 Effect of emulsification temperature on the absolute value of Zeta potential

2.2.4 正交試驗

由表4的因素極差值大小可以看出，以Zeta電位絕對值為評價指標，影響脂肪乳液乳化工藝因素的主次順序為：B＞C＞A，最優條件組合是B1C3A1，即乳化速度10 000 r/min，乳化時間20 min，乳化溫度50 ℃。在此條件下制備脂肪乳液樣品，經過三次試驗得出 Zeta電位絕對值平均值為（38.72±0.20） mV，略高于正交試驗中最佳組合B1C3A3，因此確定B1C3A1組合為最優乳化工藝。

表4 乳化工藝正交試驗Table 4 Orthogonal design for optimization of emulsification process

脂肪乳液乳化工藝正交試驗方差分析如表5所示，結果表明乳化時間和乳化溫度的差異在α=0.05水平上都是顯著的。

表5 方差分析（α=0.05）Table 5 Analysis of variance for orthogonal experiment

2.3 高壓均質及高壓滅菌條件確定

脂肪乳液屬于熱力學不穩定的乳狀分散體系，粒徑大小和粒徑分布反映了乳液體系的穩定性，乳滴粒徑越小，分布越窄，越有利于體系的穩定[31]。同時，粒徑還影響乳液的口感以及在胃腸道中的脂肪消化與吸收[32]。而乳液粒徑大小則取決于油相類型和乳化劑類型，以及乳化、高壓均質及滅菌工藝等[33]。因此，以粒徑為評價指標，優化脂肪乳液的均質及滅菌條件。

高壓均質壓力及均質次數對乳液粒徑的影響如表6所示，通過比較脂肪初乳液在 25 MPa、50 MPa壓力下不同均質次數后的粒徑可以看出，乳液粒徑隨著均質次數增加粒徑逐漸減少，25 MPa下均質次數從1次增加到3次，乳液粒徑由（1 177.00±9.06） nm降低至（979.40±8.76） nm；均質壓力為50 MPa時，均質次數從1次增加到3次，乳液粒徑由（921.73±4.73） nm 降低至（692.20±1.18） nm，與25 MPa壓力相比，50 MPa均質壓力下均質后的乳液粒徑明顯降低，而在此壓力下均質次數增加至4次后粒徑變化不大，因此，將脂肪乳液均質條件確定為50 MPa壓力下均質3次。

表6 高壓均質條件對乳液粒徑的影響Table 6 Effect of high-pressure homogenous parameters on the size of emulsion

由于脂肪乳液體系不穩定，滅菌溫度過高或時間過長將影響脂肪乳液的粒徑，同時可能加速卵磷脂的降解，降低體系穩定性[18]。因此，選擇適宜的滅菌條件對于脂肪乳液的質量具有重要影響。為此采用壓力蒸汽滅菌法，考察在121 ℃條件下滅菌5、10、15、20 min時的滅菌效果，結果如表7所示，可以看出隨著滅菌時間的增加，脂肪乳液粒徑略有增加；滅菌時間在5 min和10 min時，滅菌后乳化體系外觀呈乳白色，狀態均勻，未見油水分離現象，室溫靜置30 d產品穩定；而當滅菌時間增加到15 min后，乳液液面有輕微漂油現象，表明此時乳化體系已處于不穩定狀態，少量油脂析出。因此，將脂肪乳液滅菌條件確定為121 ℃條件下滅菌10 min。

表7 高壓滅菌條件對脂肪乳液的影響Table 7 Effect of sterilization parameters on the size and state of the emulsion

2.4 產品穩定性評價

將制備的PKO-FESMP樣品分別在4、25及40 ℃條件下放置30、60及90 d后考察產品的穩定性，試驗結果如表8所示，可以看出在三個不同溫度下存放一定時間后乳液粒徑變化不大，不同存放條件下的脂肪乳液樣品在考察時間內保持均勻乳白色，未見油水分離，產品穩定性良好。

表8 棕櫚仁油基特醫脂肪乳液產品穩定性試驗Table 8 Stability experiment of PKO-FESMP

2.5 PKO-FESMP對小鼠血清血脂的影響

2.5.1 PKO-FESMP對試驗小鼠體重的影響

PKO-FESMP對試驗小鼠體重的影響試驗結果如表9所示，與對照組相比，各劑量組小鼠體重在試驗初始（0 d）、中期（15 d）和后期（30 d）未出現明顯差異（P＞0. 05）。

表9 PKO-FESMP對實驗小鼠體重的影響(±s)Table 9 Effect of PKO-FESMP on body weight of experimental mice

表9 PKO-FESMP對實驗小鼠體重的影響(±s)Table 9 Effect of PKO-FESMP on body weight of experimental mice

體重/g實驗組 動物數量/只 0 d 15 d 30 d空白對照組 8 40.57±4.51 43.57±5.66 45.84±6.08低劑量組 8 39.73±3.98 41.92±4.70 44.42±4.17中劑量組 8 42.12±1.95 43.57±3.08 45.96±4.38高劑量組 8 41.38±1.76 42.18±1.56 44.47±1.09商業樣品組 8 40.68±2.24 41.86±3.72 44.30±3.34

2.5.2 試驗小鼠攝食量比較

試驗各組小鼠日平均攝食量情況如圖4所示，可以看出，空白對照組小鼠日均攝食量明顯高于其他試驗組，其中低劑量組、中劑量組與空白對照組比較日均攝食量差異顯著（P＜0.05），高劑量組、商業樣品組與空白對照組比較日均攝食量差異極顯著（P＜0.01），原因是由于空白對照組食用的飼料為日糧型飼料，適口性好，小鼠比較愛吃；其他各劑量組與商業樣品組食用的是純化型低脂飼料，適口性較日糧型差，一定程度上影響動物食欲，從而影響攝食量；同時，與商業樣品組比較，高、中、低各劑量組日均攝食量無顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 實驗各組小鼠日平均攝食量比較Fig.4 Comparison of average daily food intake of experimental groups

2.5.3 PKO-FESMP對試驗小鼠血清血脂含量的影響

PKO-FESMP對試驗小鼠血清血脂含量的影響結果如表10所示。

表10 PKO-FESMP對實驗小鼠血清血脂含量的影響Table 10 Effect of PKO-FESMP on serum lipid content of experimental mice

試驗結果表明：（1）對甘油三酯（TG）含量的影響與空白對照組相比，高劑量組、中劑量組小鼠 TG含量顯著降低（P＜0.05），低劑量組 TG含量降低極顯著（P＜0.01），而商業樣品組（Microlipid）TG含量卻顯著升高（P＜0.05）；同時與商業樣品組比較，高劑量組、低劑量組 TG含量顯著降低（P＜0.05），中劑量組 TG 含量降低極為顯著（P＜0.01）；（2）對總膽固醇（TC）含量的影響與空白對照組相比，高劑量組 TC含量顯著降低（P＜0.05）；與商業樣品組比較，高劑量組TC含量降低極為顯著（P＜0.01）；（3）對低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量的影響中劑量組LDL-C含量較空白對照組升高明顯（P＜0.05），然而高劑量組LDL-C含量較商業樣品組顯著降低（P＜0.05）；（4）對高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量的影響與空白對照組比較，低劑量組與中劑量組HDL-C升高極為顯著（P＜0.01），商業樣品組 HDL-C升高顯著（P＜0.05）；同時與商業樣品組比較，低劑量組、中劑量組及高劑量組HDL-C升高差異極為顯著（P＜0.01）。

表3中PKO-FESMP油相脂肪酸組成結果顯示其不飽和脂肪酸含量接近60%，其中單不飽和脂肪酸MUFA（如C18∶1）約為29.88%±0.59%，多不飽和脂肪酸PUFA（如C18∶2、C18∶3）占比約31.12%±0.27%；PKO-FESMP具有顯著降低小鼠血清 TG（P＜0.01）、TC（P＜0.01），以及 LDL-C含量（P＜0.05）和升高HDL-C含量（P＜0.01）的能力，分析原因主要是由于其中的不飽和脂肪酸的作用。已有研究表明單不飽和脂肪酸可以降低血清TC和LDL-C的水平，同時可升高血清HDL-C[34]；多不飽和脂肪酸如亞油酸能提高 LDL-C受體活性，降低血清中LDL-C，從而降低血清TC含量[35-36]；另一方面，多不飽和脂肪酸中的α-亞麻酸能夠抑制肝內脂質及脂蛋白合成，降低血 TC、TG、LDL-C，并增加HDL-C[37]。

3 結論

本研究在設計脂肪酸均衡型油相配方基礎上，對脂肪乳液乳化、均質、滅菌等加工工藝進行優化。乳化工藝通常受乳化速度、時間、溫度等多個因素影響，因此選擇與乳化穩定性呈正相關的Zeta電位絕對值作為評價指標確定乳化工藝條件為乳化速度10 000 r/min，乳化時間20 min，乳化溫度 50 ℃；均質和滅菌工藝影響參數通常為兩個，分別為均質壓力與均質次數、滅菌壓力與滅菌時間。因此，以粒徑為評價指標可以較為直觀的進行判斷，根據試驗結果確定均質工藝為50 MPa壓力下均質三次，滅菌條件為 121 ℃滅菌 10 min。穩定性實驗結果顯示，PKO-FESMP在4、25及40 ℃條件下存放90 d穩定性良好。動物實驗結果表明，PKO-FESMP具有顯著降低血清TG含量（P＜0.01）、高劑量脂肪乳液具有降低血清TC含量（P＜0.01），以及降低LDL-C含量（P＜0.05）和升高HDL-C含量（P＜0.01）的作用，對于調節血脂水平具有一定意義。