楊小舟蛾新病毒的鑒定及其生物活性研究

劉瑞霞，謝丹潔，劉錦山，王青華＊，張永安，段立清

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所/國家林業(yè)和草原局森林保護學重點實驗室，北京 100091；3.扶溝縣森林病蟲防治檢疫站，河南 周口 461300)

楊小舟蛾（Micromelalopha sieversi（Staudinger）），屬鱗翅目（Lepidoptera）舟蛾科（Notodontidae）小舟蛾屬（Micromelalopha），分布于中國、日本和朝鮮半島。在我國，楊小舟蛾分布范圍廣，在吉林、黑龍江、河南、山東、安徽、浙江、上海、江蘇、江西和四川等地發(fā)生[1-3]。楊小舟蛾是楊、柳樹的重要害蟲，由幼蟲取食楊、柳樹葉片，嚴重時，葉片常被取食殆盡，形似火燒，嚴重影響林木的正常生長發(fā)育。國家林業(yè)和草原局(2019 年第20 號文公告)將楊小舟蛾列入三級危害性林業(yè)有害生物，同時也列入我國發(fā)生面積超過100 萬畝的林業(yè)有害生物名單中。2012 年統(tǒng)計，楊小舟蛾在山東魯西平原危害7 市48 縣，并在齊河、滕州、商河等24 個縣局部爆發(fā)成災，發(fā)生面積達16.71 萬hm2，占該地區(qū)楊樹種植總面積的28.58%[4-5]。2018 年，楊小舟蛾在河南省南陽市危害楊樹純林面積達3.33 多萬hm2[6]。2021 年，楊小舟蛾僅在河南省扶溝縣一個村的危害面積達6.80 萬hm2（扶溝縣韮園鎮(zhèn)里村）。楊小舟蛾繁殖量大，其發(fā)生世代主要取決于光照、溫度和濕度。在河南漯河地區(qū)一年發(fā)生6 代，以2、3、4 代為成災世代；在江蘇徐州一年發(fā)生5 代，主要以3、4 代成災[7]。楊小舟蛾在每年的4—9 月份都對楊樹造成危害，該時期繁殖力強，取食量大，且危害時間長。研究表明，楊樹的失葉率在60%、80%和100%時，材積損失率分別為11.9%、41.1%和56.5%[8]。因此，楊小舟蛾的防治至關(guān)重要。

化學農(nóng)藥因其易于加工、高效殺死大量個體等特點在楊小舟蛾防治中發(fā)揮了重要作用。但化學防治的大量使用會帶來負面影響，如環(huán)境污染、生態(tài)失衡、產(chǎn)品安全、人類健康等一系列的問題，這使林業(yè)害蟲的生物防治顯得尤為重要。昆蟲桿狀病毒是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）一致推薦用于農(nóng)林害蟲的生物防治安全藥劑[9]。其優(yōu)點在于對寄主有很強的專化性，對人、植物和天敵均無危害，是有效和持續(xù)控制林業(yè)害蟲的最佳生物藥劑之一[10]。

據(jù)文獻資料記載，在楊小舟蛾體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)一種病毒，即為楊小舟蛾質(zhì)型多角體病毒（Micromelalopha sieversi cypovirus,MisiCPV），該病毒于1984 年10 月在湖北省嘉魚縣林區(qū)的自然病死的楊小舟蛾蟲尸中分離獲得[11]。但有關(guān)MitrCPV 的形態(tài)特征、生物活性等未見詳細報道。本研究從河北省秦皇島市采集的楊小舟蛾病死蟲中分離純化出一株新病毒，經(jīng)超微結(jié)構(gòu)鑒定，其為顆粒體病毒，命名為楊小舟蛾顆粒體病毒（Micromelalopha sieversi granulovirus,MisiGV），生物活性測定了MisiGV 對3 齡幼蟲的半致死濃度LC50和半致死時間LT50、對不同齡期幼蟲毒力，以及對存活幼蟲化蛹率和羽化率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

楊小舟蛾病毒（秦皇島株）由中國林業(yè)科學研究院昆蟲病原微生物實驗室提供，采用梯度離心的方法得到純凈的病毒并于本實驗室4℃保存待用。楊小舟蛾各齡期幼蟲采自河南省周口市扶溝縣韮園鎮(zhèn)的里村（114.18 E°,34.6 N°），并于溫度（25 ±1）℃，相對濕度（60 ± 10）%，光周期16 L∶8 D的昆蟲飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒的復制、分離與純化 MisiGV 的復制，將MisiGV（秦皇島株）刷到新鮮楊樹（歐美楊107）葉片上，接入健康的楊小舟蛾3 齡幼蟲，待5 d 后收集死蟲并分離病毒。MisiGV 的分離純化方法參考王承銳等[12]方法，并將過程進一步優(yōu)化。具體步驟如下：將感染楊小舟蛾病毒的蟲尸放入研缽，加入2/3 體積的無菌水研磨蟲尸至勻漿，用兩層紗布過濾除去大的組織塊。濾液裝入干凈的離心管（1.5 mL），用差速離心法，分別為9 600 g，離心10 min，棄上清；20 g，離心5 min，棄沉淀；60 g，離心3 min，棄沉淀再將上清用9 600 g，離心10 min，棄上清后將沉淀懸浮，獲得較純病毒液。為了獲得更純的病毒液，利用蔗糖梯度法進一步純化。將60%、55%、50%和40%蔗糖溶液依次加入50 mL 離心管靜置過夜，然后加入上述較純病毒液，2 504 g，離心40 min。純凈病毒在50%～55%蔗糖梯度區(qū)，吸取純凈病毒用無菌水清洗3 次。血球計數(shù)板計數(shù)后，4 ℃保存待用。純凈的病毒懸浮液用于后續(xù)超微結(jié)構(gòu)觀察和生物活性測定等試驗。

1.2.2 超微結(jié)構(gòu)觀察 a.掃描電鏡樣品制樣：將300 μL 的MisiGV（3.0 × 107OBs·mL-1）懸浮液加入1.5 mL 離心管內(nèi)，用無菌水洗滌2 次，12 800 g，離心5 min，棄上清，盡量吸去多余的無菌水，在沉淀中加入2.5 %戊二醛，懸浮沉淀，常溫固定6 h以上。將固定好的病毒液用12 800 g，離心2 min，棄戊二醛上清液；用去離子水浸泡樣品6 min，12 800 g，2 min 離心后吸去去離子水，此步驟重復3 次，每次浸泡時間比前一步延長1 min。然后分別用50%、70%和85%乙醇脫水14 min，再用95%和100%乙醇浸泡15 min，其中100%乙醇脫水3 次，以上脫水過程從70%乙醇脫水開始，將病毒樣品裝入濾紙包進行的。將樣品放入臨界點干燥儀（LEICA EM CPD300）2 h 后取出，并粘至金屬臺，用離子鍍膜儀（E-1045 IDN SPUTTTER）噴金后，放入掃描電鏡（HITACHI SU8010）觀察并拍照。

b.透射電鏡樣品制樣：取純凈的MisiGV（3.0 ×107OBs·mL-1）懸浮液300 μL，用2.5%的戊二醛常溫固定6 h 以上。將固定好的病毒液12 800 g，離心2 min 吸去多余的戊二醛，用去離子水清洗3 次。沉淀中加入500 μL 溶解的瓊脂后離心，切取底部樣品放入1.5 mL 離心管中，用1 倍的磷酸緩沖液（pH 7.0）充分清洗3～5 次，每次3～5 min。沉淀中加入1%的餓酸固定1 h，并用1 倍的磷酸緩沖液（pH 7.0）充分清洗3 次以除去餓酸。用梯度丙酮（30%、50%、70%、85%和95%）在冰上脫水各5～7 min，再用100%丙酮常溫下脫水3 次。然后用不同比例的丙酮和樹脂滲透樣品，丙酮∶樹脂=3∶1，45 min；1∶1，1.5 h 和1∶3，2 h。以上滲透樣品結(jié)束后，吸出上清加入純樹脂包埋，并放入干燥器（AP 9925N）內(nèi)保存。使用Leica uc7 型切片機超薄切片，再用醋酸雙氧鈾染30 min 和檸檬酸鉛15 min 雙染色后，放入透射電鏡（JEOL JEM-1 400）觀察后拍照。

1.2.3 楊小舟蛾幼蟲生物活性的測定 a.毒力的測定 挑選健康的楊小舟蛾3 齡幼蟲放入圓柱型的養(yǎng)蟲筒中（Φ10 cm × 14 cm），饑餓24 h 后，放入含有病毒液的速生楊葉片。帶毒的葉片是用毛筆均勻刷上不同濃度梯度的病毒液各1 mL，晾干后喂食幼蟲。空白對照為刷有等量無菌水的新鮮葉片。實驗設(shè)置6 個處理，1 個空白對照和5 個濃度梯度楊小舟蛾病毒：1.2 × 107、4.0 × 106、4.0 ×105、1.2 × 105和4.0 × 104OBs·mL-1。每個處理30 頭幼蟲，3 次重復。昆蟲飼養(yǎng)室條件為溫度（25 ± 1）℃，相對濕度（60 ± 10）%，光周期16 L∶8 D。2 d 后葉片基本取食完全，換無毒的新鮮葉片。每天觀察記錄各處理的幼蟲死亡數(shù)和死亡癥狀。

b.不同蟲齡幼蟲對MisiGV 的敏感性測定選用帶有不同濃度梯度的MisiGV 葉片分別喂食楊小舟蛾2 齡、3 齡和4 齡的健康幼蟲，每個處理30頭幼蟲，3 次重復，病毒濃度為4.0 × 106和4.0 ×104OBs·mL-1，給毒方法和幼蟲飼養(yǎng)條件同上述a，每天觀察記錄各齡幼蟲的死亡數(shù)[13]。

c.MisiGV 對幼蟲化蛹率和羽化率的影響每個處理選用健康的楊小舟蛾4 齡幼蟲30 頭，3 次重復。病毒濃度為4.0 × 106、4.0 × 105和4.0 ×104OBs·mL-1，給毒方法和飼養(yǎng)條件同上述a，每天觀察幼蟲狀態(tài)并記錄化蛹數(shù)和羽化數(shù)[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 運用Excel 和SPSS 22.0 軟件的概率回歸分析計算出致死中濃度LC50和半致死天數(shù)LT50[15-17]，計算病毒液對不同齡期幼蟲的累計死亡率和4 齡幼蟲的化蛹率、羽化率[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微結(jié)構(gòu)

MisiGV 超微結(jié)構(gòu)如圖1 所示。掃描電鏡觀察，該病毒形態(tài)大多呈橢圓形，也有的呈卵圓形或不規(guī)則形，形似顆粒體，其平均大小為0.43 × 0.21 μm，但變化范圍較大，為(0.18～0.76) × (0.20～0.23) μm，（圖1A）。從透射電鏡可觀察到該病毒內(nèi)部的詳細結(jié)構(gòu)，顆粒體的周圍顏色較深的一層為顆粒體膜，膜內(nèi)一層為顆粒體的蛋白質(zhì)，顆粒體中包埋著單個單粒的病毒粒子，橫切為顆粒狀，縱切為桿狀，病毒粒子位于顆粒體的中央，其平均大小為0.03 × 0.20 μm。（圖1B）

圖1 楊小舟蛾病毒超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of virus strain isolated from M.troglodyta larvae

2.2 室內(nèi)毒力測定結(jié)果

2.2.1 LC50與LT50當MisiGV 濃度為1.2 × 107、4.0 ×106、4.0 × 105、1.2 × 105和4.0 × 104OBs·mL-1時對3 齡幼蟲都有致死作用。MisiGV對3 齡幼蟲的回歸方程為：y=-3.945+0.734x，LC50為2.37 × 105OBs·mL-1（95%置信區(qū)間為1.13 × 105～4.34 × 105）（表1）。表1 中皮爾遜擬合優(yōu)度顯著性值（P）大于0.05，則模型能較好的擬合數(shù)據(jù)。

表1 不同濃度的MisiGV 對楊小舟蛾3 齡幼蟲的毒力(17 d)Table 1 Different concentrations of MisiGV to the 3rd instar larvae of M.sieversi (17 d)

不同濃度的MisiGV 對幼蟲致死速度有一定差異（表2）。LT50數(shù)據(jù)表明，當病毒濃度為1.2 ×107和4.0 × 106OBs·mL-1時，半致死時間LT50分別為7.55 d 和11.61 d，LT50相比縮短了4.06 d。當病毒濃度為4.0 × 105、1.2 × 105和4.0 × 104OBs·mL-1，LT50分別為14.69、16.06和17.62 d，該病毒濃度間相比分別相差10 倍和3 倍時，LT50分別縮短了2.93 d 和1.56 d。即隨著MisiGV 濃度的提高，LT50值縮短。表2 中皮爾遜擬合優(yōu)度顯著性值（P）均大于0.05，則模型能較好的擬合數(shù)據(jù)。

表2 不同濃度的MisiGV 對楊小舟蛾3 齡幼蟲時間-死亡率的影響(17 d)Table 2 Different concentrations of MisiGV on time-mortality of the 3rd instar larvae of M.sieversi (17 d)

2.2.2 不同蟲齡幼蟲對MisiGV 的敏感性 圖2 顯示，在MisiGV 濃度為4.0 × 106和4.0 × 104OBs·mL-1時，其對2～4 齡幼蟲都表現(xiàn)出一定的毒力。在這2 個濃度下，2 齡幼蟲的最高累計死亡率分別為90.00%和83.33%（圖2A），3 齡幼蟲的最高累計死亡率分別為85.56%和50.58%（圖2B），4 齡幼蟲的最高累計死亡率分別為57.78%和36.67%（圖2C）。也就是說，在同一齡期不同病毒濃度下，病毒液濃度越高，幼蟲的死亡率隨之增加。

圖2 不同濃度的MisiGV 對不同蟲齡幼蟲的累計死亡率Fig.2 Different concentrations of MisiGV to cumulative mortality of larvae at different instars

當濃度為4.0 × 106OBs·mL-1時，2 齡幼蟲的累計死亡率在2～10 d 呈顯著上升趨勢，且在第11 d達最高累積死亡率，11 d 之后呈穩(wěn)定趨勢；3 齡幼蟲在5～8 d 內(nèi)累計死亡率緩慢增大，而在8～13 d內(nèi)累計死亡率呈顯著上升趨勢，且在13 d 時累計死亡率達最高值，之后幾天趨于穩(wěn)定；而4 齡幼蟲的累計死亡率在9 d 之內(nèi)沒有顯著性的變化，第15 d累計死亡率達到最大，而往后天數(shù)里死亡率幾乎維持不變。當濃度為4.0 × 104OBs·mL-1時，2 齡幼蟲在3～15 d 內(nèi)累計死亡率呈顯著上升，第15 d時達最高累計死亡率并往后幾天內(nèi)趨于穩(wěn)定；3 齡幼蟲在6～10 d 的累計死亡率緩慢增大，11～14 d內(nèi)呈緩慢增長，無明顯變化，16～19 d 時累積死亡率達最高值并趨于穩(wěn)定；4 齡幼蟲在第10～13 d時增長緩慢，累計死亡率在15～18 d 內(nèi)隨之上升，且18 d 時達最高累計死亡率。

同一劑量病毒，殺死相同比例的楊小舟蛾幼蟲，高齡比低齡幼蟲的所需的時間長。在濃度為4.0 × 106OBs·mL-1時，2 和3 齡幼蟲LT50值分別為≈6.81 d 和≈11.61 d，而殺死50%的4 齡幼蟲所需時間為≈12.89 d（表3）。當病毒濃度為4.0 × 104OBs·mL-1時，殺死50%的2 齡幼蟲的所需時間≈11.91 d、3 齡≈17.62 d，4 齡≈25.65 d（表3）。采用時間-劑量-死亡率模型進行模擬分析發(fā)現(xiàn)，在這兩個病毒濃度下，皮爾遜擬合優(yōu)度顯著性值（P）均大于0.05，擬合線性回歸方程，則模型能較好的擬合數(shù)據(jù)。

表3 不同濃度MisiGV 對不同蟲齡楊小舟蛾的致死時間Table 3 Different concentrations of MisiGV on time-mortality of larvae at different instars

在測試3 個齡期的幼蟲中，兩個劑量的病毒的LT50顯著不同。對于2 和3 齡幼蟲而言，在濃度4.0 × 104OBs·mL-1和4.0 × 106OBs·mL-1時，兩者的LT50分別相差≈5.10 d 和≈6.01 d。而對于4 齡幼蟲而言，低濃度比高濃度病毒的LT50增加≈12.76 d。可見，對于蟲齡小的幼蟲而言，濃度之間的差異，導致其LT50變化不大，而對于蟲齡大幼蟲而言，病毒濃度的變化，導致LT50差異顯著。盡管4.0 × 104OBs·mL-1較4.0 × 106OBs·mL-1稀釋了100 倍，但對于2 齡幼蟲而言，其濃度還是很高，以至于他們的死亡率都在80%以上。

2.2.3 不同濃度的MisiGV 對存活幼蟲化蛹率和羽化率的影響 不同濃度的MisiGV 喂食4 齡幼蟲后，存活幼蟲化蛹率和羽化率如表4 所示。當病毒液濃度為4.0 × 106、4.0 × 105和4.0 × 104OBs·mL-1時，幼蟲的化蛹率分別為30.00% ± 2.65%、51.11% ± 0.33%和62.22% ± 1.20%，較對照組相比，化蛹率分別減少52.27%、31.16%和20.05%。因此，不同濃度的MisiGV 對化蛹率有影響，化蛹率隨著病毒液濃度的提高而減弱。

表4 不同濃度的MisiGV 對幼蟲化蛹率和羽化率的影響Table 4 Effects of different concentrations of MisiGV on the pupation rate and emergence rate of larvae

當病毒液濃度為4.0 × 106和4.0 × 105OBs·mL-1時，幼蟲的羽化率分別為73.97% ± 2.06%和82.64% ± 2.05%，較對照組相比，羽化率分別減少了19.57%和10.90%。不同濃度的MisiGV 對其羽化率有影響，病毒液濃度越高，羽化率越低。而當4.0 × 104OBs·mL-1時，幼蟲的 羽化率 為92.20% ± 0.47%，較對照組相比，羽化率減少了1.34%。因此，在較低濃度下，對幼蟲羽化率的影響不明顯。

3 討論

本研究分離的新病毒株為楊小舟蛾顆粒體病毒MisiGV，其在主要形態(tài)特征方面與GVs 一致。楊小舟蛾（Micromelalopha sieversi(Staudinger)）和楊扇舟蛾（Clostera anachoreta(Fabricius)）同為舟蛾科，且兩者常混合發(fā)生，是危害楊樹的重大害蟲。1966 年蔡秀玉等[19]首次發(fā)現(xiàn)楊扇舟蛾顆粒體病毒（Clostera anachoreta granulovirus,ClanGV），1981 年，報道了與楊扇舟蛾同屬的分月扇舟蛾顆粒體病毒（Clostera anastomosis L.granulovirus,CaLGV）[20]。通過MisiGV 與ClanGV、CaLGV 相比較發(fā)現(xiàn)，三者在超微結(jié)構(gòu)和生物活性方面有一些不同。首先，在顆粒體直徑方面，ClanGV平均直徑大小為0.44 ×0.22 μm，CaLGV 為 0.43 × 0.24 μm[21-22]，MisiGV 為0.43 × 0.21 μm。其次，病毒粒子存在差異，ClanGV 病毒粒子平均大小約為0.15～0.04 μm，CaLGV 為0.22 × 0.06 μm，而MisiGV 的大小約為0.20 × 0.03 μm。最后，3 者在毒力方面存在差異。ClanGV 感染楊扇舟蛾4 齡幼蟲后，其LC50為1.25 × 106OBs·mL-1[23]；李海霞等[24]發(fā)現(xiàn)CaLGV 感染分月扇舟蛾2 齡幼蟲，LC50為2.97 × 105OBs·mL-1；MisiGV 對楊小舟蛾3 齡幼蟲的LC50為2.37 × 105OBs·mL-1。因測試蟲和蟲齡的不同三者的LC50值的無法比較毒力大小。當CaLGV 濃度為1.0 × 107OBs·mL-1時，感染分月扇舟蛾3 齡幼蟲后，LT50值為7.74 d[21]；而當MisiGV 濃度為1.2 × 107OBs·mL-1時，感染楊小舟蛾 3 齡幼蟲的 LT50為 7.55 d（表 2）。可見，在CaLGV 和MisiGV 濃度相差不大時，MisiGV在殺死50%的3 齡幼蟲所需的時間與CaLGV 的時間無明顯差異。另外，MisiGV 與ClanGV 在LT50值的比較上，當ClanGV 濃度為3.0 × 105OBs·mL-1時，對3～4 齡楊扇舟蛾幼蟲LT50值為12.20 d[24-25]；而 MisiGV 濃度為 1.2 × 105OBs·mL-1對3 齡楊小舟蛾幼蟲LT50值為16.06 d。此外，CaLGV 對楊扇舟蛾和分月扇舟蛾的幼蟲都具有致病性[24]。MisiGV是否能夠感染楊扇舟蛾和分月扇舟蛾幼蟲，其LC50與LT50的結(jié)果是否與感染原寄主存在差異性，還有待開展后續(xù)試驗進一步驗證。

致死時間的長短是判斷病毒能否作為一種有潛力的生物防治制劑的一個關(guān)鍵因素[26]。如果病毒能夠提高殺蟲速度，縮短寄主致死時間，就能夠在一定程度上提高病毒水平傳播速度[25]。文中數(shù)據(jù)顯示，致死時間隨著蟲齡和病毒濃度的增加而減少（表2，3）。對于殺死50%的2～3 齡幼蟲而言，當濃度為4.0 × 106OBs·mL-1時，3 齡的致死時間≈11.61 d，而4 齡LT50為12.89 d。在致死時間保持不變的條件下，在幼蟲發(fā)生的早期進行野外噴灑病毒，這樣在很大程度上會增加病毒在幼蟲之間的水平傳播。考慮到防治成本和防治效果，應在幼蟲1 齡至3 齡期間，最好在孵化始期施用，此時幼蟲對病毒較敏感，對楊樹的為害尚輕，喜群聚取食，易于疾病的流行，施用病毒制劑時也較節(jié)省勞力，防治效果好。

昆蟲桿狀病毒因?qū)Ｒ恍詮姟⒖沙掷m(xù)控制的優(yōu)點，越來越受到人們的重視并應用于防治農(nóng)林害蟲[27]。本研究獲得的MisiGV 新病毒株對楊小舟蛾幼蟲有極強的致病性，在高劑量病毒下，幼蟲可在相對較短時間死亡。即使在低劑量濃度下，存活幼蟲的化蛹率降低，可見，MisiGV 可作為防控楊小舟蛾的一理想生物因子。

4 結(jié)論

本文報道的MisiGV 新病毒對楊小舟蛾幼蟲有很強致病性，為該害蟲的生物防治提供新病毒資源。