堿水解-分光光度法測定食品中的色氨酸含量

◎ 呂浩宇

（譜尼測試集團股份有限公司，北京 100080）

L-色氨酸（L-Tryptophan）是人體必需的一種氨基酸[1]，人體每天需要的色氨酸來自內源蛋白質的分解和食物的消化吸收，這些色氨酸除用于蛋白質生物合成外，主要在肝、腎、腦等組織器官發生代謝[2]。色氨酸會在吲哚胺-2,3-雙加氧酶、單胺氧化酶等作用下，通過色氨酸-5-羥色胺（5-HT）和色氨酸-犬尿氨酸（Kyn）兩條主要途徑降解并排出體外[3]。受機體飲食以及機體狀態的影響，每天攝入的Trp以及參與代謝的酶會發生變化，這些細小的變化會造成機體代謝狀態的差異，最終導致疾病的發生。嬰幼兒如果缺乏色氨酸，會導致其出現蛋白質和脂肪代謝障礙，影響其正常生長發育。我國《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）[4]標準中，均規定嬰幼兒食品中允許添加L-色氨酸，并對含量有明確要求。但我國缺乏各類食品中色氨酸含量的檢測標準，使政府監管和企業質量控制難以有效開展。

色氨酸的檢測方法主要有分光光度計法[5]、離子交換色譜法[6]、液相色譜法[7]和液-質聯用法[8]等，前處理過程一般為堿水解法[9]。本研究建立了一種準確測定各類食品中包括米面制品、水產品、豆類等色氨酸含量的堿水解-紫外可見分光光度法。該法準確度高、重現性好，對各類食品的測定結果滿意，可用于市面上各類產品中色氨酸含量的安全檢測和監督抽檢，為色氨酸的監管提供了技術支持，同時也是對目前色氨酸檢測方法的一種優化和補充，并且可以指導人們科學膳食。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

H1850臺式高速離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；組織搗碎機：荷蘭皇家飛利浦電子公司；分析天平（感量0.1 mg）：瑞士METTLER TOLEDO公司；ST-04A多功能粉碎機：上海樹立儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計：日本島津公司；容量瓶；培養箱；比色管；刻度吸管；單刻度吸管。

1.2 試劑與溶液

硫酸溶液（21.2 moL·L-1）；氫氧化鉀溶液（10%）；亞硝酸鈉溶液（0.2%）；對二甲氨基苯甲醛溶液（1%）；L-色氨酸：對照品（純度≥99.0%）；L-色氨酸標準溶液（100 μg·mL-1）。試劑均為分析純，水為二級水。

1.3 試驗步驟

1.3.1 樣品的預處理

選取具有代表性的樣品，對于水分含量較小的樣品需按四分法縮分至300 g，粉碎并全部通過孔徑為0.25 mm的篩（60目）；對于水分含量較大的樣品需用組織搗碎機將樣品打成勻漿，過濾，濾液備用。

1.3.2 工作曲線的繪制

準確吸取色氨酸（100 μg·mL-1）標準溶液0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL和0.70 mL（相當于20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg和70 μg色氨酸）分別置于10 mL帶塞比色管中，并補加水至1.00 mL，同時吸取1.00 mL水于10 mL帶塞比色管中作為試劑空白。于各個標準管及空白管中加入10%氫氧化鉀溶液1.00 mL，混勻，并將標準管與空白管放入裝有冷水的容器中，加入1%對二甲氨基苯甲醛溶液5.00 mL，從裝有冷水的容器中取出所有比色管，搖勻，于室溫放置30 min。向上述各個標準管及空白管內加入0.2%亞硝酸鈉溶液0.20 mL，搖勻，于室溫放置25 min。用1 cm比色杯，以試劑空白管調節零點，于590 nm處測各個標準管的吸光度，繪制標準工作曲線，列出回歸方程式。

1.3.3 樣品測定

稱取上述制備好的樣品0.2～1.0 g，精確至0.1 mg。對于脂肪含量＞4%的樣品，稱好樣品后，需將其脫脂后再進行后續操作。將樣品置于50 mL容量瓶中，緩慢加入10%氫氧化鉀溶液25 mL，并輕輕振搖使樣品完全濕潤并且不粘壁，置于（40±2）℃培養箱中水解16～18 h（必須保證16 h，只有水解16 h后，數據才穩定）。取出水解后的樣品冷卻至室溫后，用水定容到50 mL，搖勻，取部分水解后的樣品溶液以4 500 r·min-1轉速離心15 min，取上清液備用，如樣品水解液比較澄清可直接過濾，濾液備用。吸取上清液或濾液2.00 mL置于樣品比色管中，并將樣品比色管放入裝有冷水的容器中，加入1%對二甲氨基苯甲醛溶液5.00 mL，搖勻。另吸取每個樣品的上清液2.00 mL于比色管中，加硫酸溶液5.00 mL作為樣品空白，搖勻，于室溫放置30 min。然后于各個樣品比色管及樣品空白管中加入0.2%亞硝酸鈉溶液0.20 mL，搖勻，于室溫放置25 min。用1 cm比色杯，以試劑空白管調節零點，于590 nm處測定樣品空白（Akb）的吸光度和樣品溶液（A）的吸光度。樣品溶液的吸光度值（A）減去樣品空白的吸光度值（Akb），得到樣品凈吸光度值。

1.3.4 計算結果

試樣中色氨酸含量計算為：

式中：m為試樣質量，g；c為從工作曲線上查得色氨酸含量，μg。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

配制上述6個不同濃度的標準溶液，色氨酸含量分別為20 μg、30 μg、40 μg、50 μg、60 μg和70 μg，并測定此6個濃度標準溶液的吸光度。以含量（X，μg）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標作圖可得一直線，經最小二乘法計算，得到線性回歸方程為y=0.007 22x-0.004 6，相關系數的R2=0.999 7。在0～70 μg色氨酸含量與吸光度具有良好的相關性。

2.2 精密度試驗

為驗證方法的可行性，本試驗從市場購買了各類產品，如小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉進行驗證，產品品類涉及糧食、蛋類、肉類、菌類和海產品等，同時油脂含量高的首先經過脫脂之后再進行色氨酸含量的測定，結果見表1。

表1 各類產品中色氨酸的含量表

由表1可知，各類產品中色氨酸含量測定重復性好，RSD均＜2.0%，同時發現蛋白質含量較高的豆類產品中色氨酸含量相比其他類產品含量較高，色氨酸含量高達0.471%；其次是魷魚和紫菜，其色氨酸含量分別為0.385%和0.380%，再次是牛肉，色氨酸含量為0.365%，所以為補充色氨酸的攝入量，可以優先選擇食用蛋白質較高的豆類、海產品和肉類。

2.3 準確度試驗

精密稱取小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉產品，對樣品進行不同梯度的加標，并按照上述1.3.3的試驗操作流程，連續測定6次，計算其準確度，結果見表2。

由表2可知，色氨酸在小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉產品中進行不同梯度的加標后，回收率在93.6%～97.0%，回收效果良好，相對標準偏差均小于5.0%，該方法精密度高，準確度好，符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中回收率范圍和精密度的要求，具有良好的重現性，方法可操作性強，適合于各類產品中色氨酸含量的檢測，可用于市面上各類產品中色氨酸含量的安全檢測和監督抽檢，為各類食品中色氨酸含量的監管提供了技術支持。

表2 色氨酸在各類產品中的加標回收率表（n=6）

2.4 檢出限和定量限

以試劑空白溶液重復測20次，按3倍信噪為此光度法檢出限，按10倍信噪為此光度法定量限。通過20次的測定，并以最大取樣量為1.0 g，帶入1.3.4中的公式進行計算，得出檢出限為0.005%，定量限為0.014%。

3 結論

隨著人們對色氨酸的重視程度越來越高，用于色氨酸檢測的眾多技術，如前處理方法、光譜法、色譜法等在檢測準確度、精密度、自動化測定方面在不斷革新。但液相色譜法操作復雜、影響因素多；毛細管電泳法分辨率及選擇性低；氨基酸自動分析儀昂貴、運行費用高。因此，色氨酸檢測技術未來的研究趨勢可以將多種檢測技術融合、取長補短，開發普遍適用、準確快捷的測定食品中色氨酸含量的方法。本研究通過堿水解-分光光度法，建立了小米、面粉、雞蛋、大豆、牛肉、蘑菇（干）、魷魚、紫菜、葵花籽和全脂乳粉中色氨酸含量的測定方法。其回收率在93.6%～97.0%，RSD＜5.0%，該方法準確度好，靈敏度高，適用于各類產品如海產品、糧食、乳粉、堅果籽類中色氨酸含量的檢測，為驗證方法的可行性，購買了各類產品進行驗證，將該方法應用于實際各類食品中色氨酸含量的檢測。結果表明，不同產品的樣品之間，色氨酸的總量差異較大。該方法對于市面上可接觸到的食品進行安全性監察提供了技術支持和指導，并且可引導人們合理膳食，既要積極補充色氨酸，也不能過量食用色氨酸含量較高的產品，以免造成肝臟和腎臟的色氨酸代謝紊亂，引發疾病。