林下三七不同部位萜類成分分析

◎ 谷海燕，熊冰杰，應支萍，何紅霞，施 蕊

（西南林業大學，云南 昆明 650224）

三七是我國特有的藥食兩用的植物資源，三七中所含的萜類活性成分具有抗炎、抗癌、治療糖尿病等效用，其化學成分研究與應用主要集中于根部，導致三七資源綜合利用率低[1-3]。三七產業鏈短、精深加工程度低的主要原因是缺乏科學的理論支撐[4]。為提高三七資源綜合利用率，檢測分析三七不同部位的萜類成分顯得尤為重要。梁正維等[5]為促進三七的深度開發利用，利用液相色譜質譜聯用法（Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LCMS）、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定三七花中皂苷、多酚及氨基酸的組成及含量，LC-MS檢測到皂苷等39種活性成分，HPLC測定了14種皂苷、10種多酚及17種氨基酸的含量，說明地上三七具有潛在的開發價值。SUN等[6]從三七葉片中分離得到4種次級皂苷，即總皂苷XVIl、人參皂苷Rd2、三七皂苷Fe和三七皂苷Fd，為三七的進一步開發利用提供了支撐。

目前，代謝組學技術已經成功應用到植物不同部位化學成分變化規律的研究中[7-8]。本研究使用代謝組學分析技術結合UPLC-QTOF-MS對三七不同部位萜類代謝產物進行檢測，篩選出不同部位的共有萜類活性物及葉片相對于根含量顯著升高的萜類。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

三七樣品采集于瀾滄竹塘（22.74°N，99.82°E，高1 457.39 m），按不同部位分為果實（F）、葉片（L）、根（R）、莖（S）4組樣品，每組3次生物學重復，共12個樣品；甲醇（色譜純，Merck）；乙腈（色譜純，Merck）；標準品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）；純水。

超高效液相色譜和串聯質譜儀；凍干機（Scientz-100F）；研磨儀（MM 400，Retsch）；離心機；渦旋儀；精密天平。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備和提取

三七冷凍干燥后分為果實、葉片、根、莖，分別研磨成粉備用。精密稱定100 mg粉末溶解于1.2 mL的70%甲醇提取液中，借助渦旋儀充分混勻后，放置4 ℃冰箱冷藏過夜?；旌弦河秒x心機離心（12 000 r·min-1）10 min，吸取上清液，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾得到濾液，裝入進樣瓶進樣分析。

1.2.2 代謝組學檢測

采用Agilent SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進行色譜分離；設置柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1，進樣量4 μL；選用超純水（加入0.1%的甲酸）為流動相A相，乙腈（加入0.1%的甲酸）為B相進行梯度洗脫。

采用三重四極桿線性離子阱質譜儀（QTRAP）進行質譜分析，配備ESI Turbo離子噴霧接口；渦輪噴霧離子源操作參數設置源溫度550 ℃，離子噴霧電壓（IS）5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負離子模式），離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和簾氣（CUR）分別設置為344.74 kPa、413.69 kPa、172.37 kPa，碰撞誘導電離參數高。

1.2.3 數據處理

基于自建數據庫MWDB（Metware Database）根據二級譜信息對萜類代謝物定性，運用三重四級桿質譜的多反應監測模式進行定量分析。利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據，利用MultiaQuant軟件對所有物質質譜峰進行積分校正。PCA用R軟件（www.r-project.org/）的內置統計prcomp函數。皮爾遜相關系數利用R軟件的內置cor函數計算。

2 結果與分析

2.1 萜類代謝物的定性定量分析

試驗樣品中，共檢測到萜類代謝產物59種，包括1種倍半萜（3'-O-D-葡萄糖酰龍膽苦苷）、3種倍萜[去氫催吐蘿芙葉醇、京尼平苷酸、京尼平-1-O-（2''-O-芹糖基）葡萄糖苷]、10種三萜（羽扇豆酮、熊果酸、白樺脂酸等）及15種三萜皂苷（人參皂苷K、人參皂苷Rh2、人參皂苷F1等）。MRM代謝物檢測多峰圖見圖1。

圖1 MRM代謝物檢測多峰圖

2.2 主成分分析

主成分分析能顯示組間代謝物差異，確定樣品間結構的穩定性，樣本點的距離越近，樣品相似度越高[9]。圖2中第一主成分（PC1）貢獻率為42.45%，第二主成分（PC2）貢獻率為26.41%，各組出現了分區，組內聚合性好，說明不同部位萜類代謝物質有所差異。

圖2 PCA-2D得分圖

2.3 差異代謝物篩選

2.3.1 共有顯著差異代謝物分析

根據韋恩圖（圖3）和共有差異代謝物統計表（表1），發現三七不同部位共有5種顯著差異代謝物，即人參皂苷Rg2、Vina-人參皂苷R1、三七皂苷R1、人參皂苷Ro和人參皂苷Rc。人參皂苷Rg2、Vina-人參皂苷R1、三七皂苷R1和人參皂苷Ro在三七根中含量最大，其次是莖；三七葉和莖中人參皂苷Rc的含量高于根和果實中人參皂苷Rc的含量。

表1 共有差異代謝物統計表

圖3 韋恩圖

人參皂苷Rc屬于人參二醇類人參皂苷，是多種名貴中藥的關鍵活性成分之一。先前的研究證實人參皂苷Rc具有很強的抗炎和抗氧化活性[10]。此外，人參皂苷Rc還可以治療胰島素抵抗[11]，抵抗心腦血管疾病和神經損傷[12]，改善非脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化腹水[13]。王耀振[14]利用高糖、高熱量和高熱量食物建立了胰島素抵抗小鼠模型，科學地研究了小鼠體內ACE2和MAS的mRNA表達，以及人參皂苷Rc作用下與胰島素抵抗相關的炎癥和炎癥因子的安全通道。結果表明，人參皂苷Rc具有抗炎作用，并能增加ACE2/Ang-（1-7）/MAS軸，改善胰島素抵抗。

2.3.2 特有顯著差異代謝物分析

在L_vs_R特有差異代謝物統計表（表1）和L_vs_R差異代謝物火山圖中，31種特有差異代謝物有15種呈上調表達，16種呈下調表達，其中11-酮基-熊果酸、27,28-二羧基熊果酸、京尼平-1-O-（2''-O-芹糖基）葡萄糖苷、人參皂苷K、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rf1、三七皂苷T2、人參皂苷Rk1、三七皂苷Ft1、三七皂苷Fd、三七皂苷Fe*、人參皂苷Rd、人參皂苷Rc、三七皂苷L、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rb1在葉片中的含量高于三七根中。

人參皂苷具有廣泛的生物活性，包括刺激免疫功能[15]、改善血管疾病[16]、提高抗應激狀態能力[17]、改善記憶力[18]、抑制腫瘤生長[19]和抗抑郁[20]。在以往的研究中發現，人參皂苷Rh2具有抗增殖、抗腐蝕、抗轉移、阻斷細胞周期、促進分化和逆轉多種腫瘤干細胞的多藥耐藥活性，并能減少放療后的不良反應[21]。人參皂苷Rh2是天然草藥中的有效成分，有望用于癌癥治療。

表2 L_vs_R特有差異代謝物統計表

3 結論

本研究通過超高效液相色譜串聯質譜分析了三七的根、莖、葉和果實中的萜類化學成分。此外，通過主成分分析法對三七根、莖、葉和果實中的萜類代謝物進行組間差異性和組內穩定性檢測，并篩選出根、莖、葉及果實的共有萜類代謝物和葉片中萜類含量高于根的成分。結果表明，共檢測到萜類代謝產物59種，包括1種倍半萜、3種倍萜、10種三萜和15種三萜皂苷；根、莖、葉及果實中都包含了人參皂苷Rg2、Vina-人參皂苷R1、三七皂苷R1、人參皂苷Ro和人參皂苷Rc 5種化學成分；三七葉和莖中人參皂苷Rc的含量高于根和果實中人參皂苷Rc的含量；11-酮基-熊果酸、27,28-二羧基熊果酸、京尼平-1-O-（2''-O-芹糖基）葡萄糖苷、人參皂苷K、人參皂苷Rh2等在葉片中的含量高于根中。