北部灣海鴨蛋蛋黃色澤與5種天然色素含量的關聯分析

◎ 王 華，蒙麗瓊，黃芯語，金其揚，董志梅

（廣西中檢食品檢測有限公司，廣西 北海 536000）

廣西北部灣區域（主要是指欽州市、北海市、防城港市），具有得天獨厚的天然紅樹林灘涂，海水退潮后，灘涂上會留下小魚、小蝦、小蟹和藻類等海洋生物，這些高蛋白天然餌料成了海鴨的美食，海鴨產的海鴨蛋富含鐵、鎂、碘、鈣、磷和硒等多種對人體有益的微量元素和維生素，富含蛋白質、氨基酸和益于增強智力的卵磷脂，且腦磷脂總量也比普通鴨蛋高[1]。海鴨將小蝦中的蝦青素、海藻中的β-胡蘿卜素，富集于所產的蛋黃中，使蛋黃顏色更深，甚至呈現紅黃色。由于目前對于海鴨蛋的研究主要集中于磷脂組成、脂肪酸組成、氨基酸和微量元素等方面，對于蛋黃中天然色素的含量組成研究較少或不全面[2-6]。基于此，本文研究通過合理的前處理提取方法，采用高效液相色譜法同時測定海鴨蛋蛋黃中天然存在的類胡蘿卜素，并根據其測定總量和采用羅氏比色扇法測定的蛋黃色澤對比，分析兩者之間的相關規律。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鉀（分析純，西隴化工）；無水乙醇（分析純，西隴化工）；抗壞血酸（分析純，廣東光華科技）；木瓜蛋白酶（活力1.5～10 units/mg，SIGMA公司）；石油醚（分析純，西隴化工），乙醚（分析純，西隴化工）；無水硫酸鈉（分析純，國藥集團）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；試驗用水由Milli-Q Integral 10超純水機制備；玉米黃素（88.8%，德國Dr.Ehrenstorfer）；葉黃素（90.08%，美國Sigma-aldrich公司）；蝦青素（96.9%，德國Dr.Ehrenstorfer）；角黃素（96.8%，上海安譜公司）；β-胡蘿卜素（96.7%，上海安譜公司）。

在北海市、欽州市各采購10批次海鴨蛋樣品，每批次樣品采購數量不少于20個。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀（配DAD檢測器，美國安捷倫公司）；BUCHIR-3旋轉蒸發儀（瑞士步琦公司）；SHZ-88恒溫水浴振蕩器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠司）；Milli-Q Integral 10超純水機（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標液的配制

各稱取不同標準物質約10 mg，各加入1 mL二氯甲烷和無水乙醇溶解后，用色譜純乙腈定容至10 mL，配制成1 000 mg·L-1的不同物質的母標液，各取1 mL用色譜純乙腈定容至10 mL，配制成100 mg·L-1的β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素和蝦青素混合標準溶液，各取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL的100 mg·L-1混標于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度并 搖 勻 配 制 成0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1的系列標準工作溶液，用于測定。

1.3.2 樣品制備

每批次各取10個，清洗干凈外殼，打碎去除蛋清后，先用羅氏比色扇法比色記錄其色度（取其平均值作為色度的最終結果），然后勻漿后作為天然色素的測定樣品處理用。

1.3.3 樣品提取

稱取均質樣品5.0 g（精確至0.01 g）置于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸，加50 mL 45～50 ℃溫水混勻，加入0.5 g木瓜蛋白酶，蓋上瓶塞，置（55±1）℃恒溫水浴箱內振蕩處理30 min后，加入50 mL無水乙醇，搖勻，再加入25 mL氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預熱至（55±2）℃的恒溫振蕩水浴箱中，皂化30 min，取出靜置，冷卻到室溫，轉入250 mL分液漏斗，各用石油醚+乙醚（1+1，V/V）50 mL 洗滌錐形瓶后轉入分液漏斗萃取3次，合并3次的有機相萃取層，用50 mL一級水洗滌至中性后，過無水硫酸柱后于40 ℃旋轉蒸發濃縮至干，用5 mL乙腈溶解后，取2 mL于5 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋1 min，以8 000 r·min-1離心5 min，棄去正己烷相，下層乙腈相過0.22 μm濾膜后，進行分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Athena C30HPLC Column（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，以甲醇+1%磷酸水+叔丁基甲醚作為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，DAD檢測器，檢測波長474 nm，柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流動相A：甲醇；流動相B：1%磷酸水；流動相C：叔丁基甲醚，梯度洗脫程序如表1所示。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

動物自身不能合成類胡蘿卜素，其體內的類胡蘿卜素來源于食物鏈富集，主要包括植物和微生物[7]。自然界主要的類胡蘿卜素有β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素、蝦青素和辣椒紅素等，由于辣椒紅素主要來源于辣椒，因此本試驗不考慮辣椒紅素，只設計測定海鴨食物鏈中可攝入的β-胡蘿卜素、角黃素、玉米黃、葉黃素和蝦青素。

由于目前國家強制性或推薦性標準中沒有統一的可同時測定上述5種類胡蘿卜素的方法，但每種類胡蘿卜素均有其單一的分析方法，其原理基本一致，差異在于提取原理不同，角黃素、玉米黃和葉黃素存在方式為游離態，采用有機溶劑直接提取，β-胡蘿卜素和蝦青素為絡合態和游離態并存，為了充分提取，一般采用皂化處理的方式，使其均釋放成游離態色素，再采用有機溶劑萃取后，濃縮定容進行液相定量分析。盡管有文獻采取乙腈直接提取3次，濃縮后進行測定的方法，但對于蝦青素和β-胡蘿卜素的測定結果有明顯的影響，測定結果影響見表2，因此本試驗統一采用先皂化后萃取的方式進行提取。

表2 直接提取和皂化后提取對蝦青素和β-胡蘿卜素的測定結果表

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

有文獻研究報道[8]，采用高效液相色譜法測定類胡蘿卜素，C30色譜柱相比C18色譜柱（在相同的流動相、相同的柱長和填料粒徑條件下）在分離度上具有明顯的優勢，能更高效地分離類胡蘿卜素的同分異構體。因此，本實驗室采取C30色譜柱進行了確證，發現C30色譜柱在分離度上具有更明顯的優勢，能分離出更多的雜質峰。因此，本文選用Athena C30HPLC Column（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，C30色譜柱的標樣和樣品典型色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 C30色譜柱的標液分離效果圖

圖2 C30色譜柱的樣品分離色譜圖

2.2.2 流動相的梯度沖洗優化

類胡蘿卜素屬于弱極性化合物，C30色譜柱原理上也屬于反相非極性色譜柱，隨著非極性溶劑比例增強，洗脫速度加快，本試驗選用的非極性溶劑主要是叔丁基甲醚，本試驗的5種物質中，玉米黃素和葉黃素屬于同分異構體，分離的關鍵在于玉米黃素和葉黃素的分離度是否良好，如果叔丁基甲醚的梯度沖洗起始比例太高，會造成這兩種物質的難以分離，但如果起始比例太低，又會造成其他物質洗脫時間過長增加了整個樣品的分析時間，影響分析效率，同時液相色譜分析常向流動相中加入1%磷酸（或1%乙酸、1%的甲酸等），可抑制溶質的離子化，獲得對稱的色譜峰。因此，通過不同比例的沖洗程序試驗，最終選定本試驗中的梯度沖洗程序，具體見表1。

2.2.3 線性關系

液相色譜法屬于經典色譜法，以0.5 μg·mL-1、

1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和50.0 μg·mL-1為橫坐標，以峰面積響應值為縱坐標，擬合線性方程，以信噪比（S/N=3）的檢出質量濃度作為儀器檢出限，信噪比（S/N=10）的質量濃度作為儀器定量限，當稱樣量為5 g，定容體積為5 mL時，5種天然色素的方法檢出限和定量限結果見表3。

表3 各化合物的線性方程、相關系數和檢出限結果表

2.2.4 回收率試驗和精密度試驗

在本試驗條件下，各物質的回收率和精密度結果見表4。

表4 方法的回收率和精密度結果表（n=8）

2.2.5 色素總量測定結果與羅氏比色法測定結果對比

高效液相色譜法測定結果與羅氏比色扇法測定色度結果見表5。

表5 高效液相色譜法測定結果與羅氏比色扇法測定色度結果表

續表4

3 結論

本試驗中液相色譜法采用皂化后提取的方式，同時測定海鴨蛋中天然存在的5種天然類胡蘿卜素，該處理和分析簡單快捷，具有較低的檢出限和定量限，較好的準確度和精密度，克服了直接提取法的缺陷，測定的色素總量結果與采用羅氏比色扇法測定的色度結果具有明顯的關聯，即色素總量越高，其色度值也越高，因此可以作為海鴨蛋中天然色素的有效檢測方法。