高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度評估

◎ 許文雅，林 洋，王 韻，郁蕉竹，張宏宏

（沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136）

糖精鈉是一種合成甜味劑，被廣泛應用于食品中，其甜度遠高于蔗糖，攝入過多會對腸胃的消化吸收功能造成影響，使食欲減退，有致癌和致遺傳損害的可能性[1-2]，因此仍須嚴格控制糖精鈉在食品中的使用。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定糖精鈉在帶殼熟制堅果與籽類中的最大允許使用量為1.2 g·kg-1[3]。當檢測結果接近限量值時，檢測結果對樣品是否合格有很大影響。《測量不確定度的要求》（CNAS—CL07：2011）[4]中表明，若檢測結果的有效性與不確定度有關、或當不確定度對結果是否符合標準規定限度有影響時、或當檢測方法及法規有要求時，檢測結果必須出具不確定度報告。當初檢不合格樣品在復檢時，不確定度也是評價檢驗方法合理性與科學性的有效定量指標，所以測量不確定度的評定對檢測結果的準確性具有重要意義。本文依據國家標準《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[5]第一法高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉的含量，根據《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[6]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[7]，對高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度建立模型，對影響其不確定度的因素進行系統的分析和評定，為同類樣品檢測結果超出限量的判斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

高效液相色譜儀[Waters e2695（配2998PDA檢測器），美國Waters公司]；分析天平[BSA224S-CW，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；電子天平[Quintix213-1CN，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；超聲波清洗器（KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機（H1750R，湖南湘儀離心機儀器有限公司）；超純水機（Milli-Q reference，Millipore SAS公司）；移 液 器[（20～200 μL，705878；100～1 000 μL，705880），普蘭德公司]；移液器[（5～50 μL，NZ44739），Thermo公司]。

1.2 材料與試劑

糖精鈉標準品[（1 000 mg·L-1，以糖精計760 mg·L-1），北京海岸鴻蒙標準物質技術有限公司]；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）；乙酸銨（色譜純，Fisher chemical）；超純水[（電導率：18.2 MΩ·cm，25℃），自制]；水系濾膜（0.45 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）；香烤瓜子（企業復檢樣品，盤錦長久食品有限公司）。

1.3 實驗方法

樣品用水提取，通過高效液相色譜進行分離，利用二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。

1.3.1 樣品前處理

精密稱量2.000 g左右的樣品，置于50 mL帶蓋塑料離心管中，加入25 mL水，振蕩混勻，置于超聲儀中超聲約20 min，取出后混合均勻，放置離心機中于8 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉移至50 mL容量瓶中，再加入20 mL水于殘渣中，搖勻后超聲5 min，離心，將上清液轉移至上述50 mL容量瓶中，用水定容，混勻后取上清液過濾膜，待測。

1.3.2 標準溶液的配制

精密量取0.05 mL糖精鈉標準品于50 mL容量瓶中，精密量取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL糖精鈉標準品于10 mL容量瓶中，用水定容 至 刻 度，配 制 成 濃 度 為1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標準工作液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Tnature C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨溶液=11∶89；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；波長：230 nm。

1.3.4 數學模型的建立樣品中糖精鈉（以糖精計）含量按下式計算：

式中：X為樣品中糖精鈉的含量，g·kg-1；C為由標準曲線得出的樣品溶液中糖精的濃度，mg·L-1；V為樣品溶液的定容體積，mL；m為樣品質量，g；1 000為換算系數。

2 不確定度來源分析

由檢驗過程和數學模型可知高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉含量的不確定度主要來源于標準工作曲線、樣品前處理、樣品測量重復性，每一種來源又分別受到不同因素的影響，其不確定度來源可分為A類和B類不確定度，其不確定來源如圖1[8]。

圖1 糖精鈉測量不確定的來源圖

A類不確定度主要是由樣品測量重復性引入的，平行測定樣品6次，計算樣品重復測定引入的不確定度u(f)。

B類不確定度主要是稱量樣品質量產生的不確定度u(m)；樣品定容體積產生的不確定度u(v)，即容量瓶誤差引入、溫度變化引入；標準曲線產生的不確定度u(c)，即標準溶液配制產生的不確定度（包括標準物質引入、移液器和容量瓶引入）和標準曲線擬合產生的不確定度。

由于各不確定度分量互不相關，其合成相對標準不確定度計算如下：

3 不確定度評定

3.1 樣品測量重復性引入的相對標準不確定度u(f)

按照1.3.1所述的前處理條件處理樣品，得到6次重復測試的結果見表1。根據貝塞爾公式得出測量重復性引入的不確定度為0.002 01 g·kg-1，相對標準不確定度

表1 樣品6次重復性測試結果表

3.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度u(m)

使用千分之一的電子天平，準確稱取2 g待測樣品，根據電子天平的檢定證書可知，所使用天平的最大允許誤差為±0.01 g，按矩形分布計算得出

3.3 樣品定容體積引入的相對標準不確定度u(v)

3.3.1 容量瓶誤差引入的不確定度u1(v)

樣品經提取后定容至50 mL容量瓶（A級）中，根據容量瓶的檢定證書，其最大允許誤差為±0.05 mL，按三角分布計算得出

3.3.2 溫度變化引入的不確定度u2(v)

容量瓶的實際校準溫度為24 ℃，實驗室溫度在（22±4）℃波動。由于溫度變化對容量瓶體積的影響明顯小于對液體體積的影響，因此可忽略容量瓶體積的變化。已知水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，則由此產生的體積變化為±50 mL×4 ℃×2.1×10-4/℃=±0.042 mL。按均勻分布，包含因子則由此引入的相對不確定度

3.4 標準曲線引入的相對標準不確定度u(c)

3.4.1 標準溶液的配制引入的相對標準不確定度u1(c)標準溶液的配制產生的不確定度u1(c)包括標準物質純度引入的不確定度u2(c)、移液器和容量瓶引入的不確定度u3(c)，則

（1）標準物質純度引入的相對標準不確定度u2(c)。糖精鈉標準溶液證書注明標準值1 000 μg·mL-1，以糖精計標準值為760 μg·mL-1，相對擴展不確定度U為1%（k=2），則相對不確定度u2(c)= 0.01/2=0.005。

（2）標準溶液配制過程中量器引入的相對標準不確定度u3(c)。使用糖精鈉標準溶液逐級稀釋，配制標準工作液，分別移取0.05 mL于50 mL容量瓶中，移 取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。在配制過程中，50 μL移液器使用1次，200 μL移液器使用2次（分別移取100 μL 1次，200 μL 1次），500 μL移液器使用1次，1 000 μL移液器使用4次（分別移取500 μL 1次，1 000 μL 3次），10 mL容量瓶使用5個，50 mL容量瓶使用1個。根據移液器和容量瓶的檢定證書，其最大允許誤差及移取體積的標準不確定度見表2，移液器按矩形分布，包含因子容量瓶按三角形分布，包含因子

表2 標準溶液配制量器移取體積引入的不確定度表

由3.3.2可知，10 mL、50 mL容量瓶由溫度效應產生的體積變化分別為±0.008 4 mL、±0.042 mL，移液器移取的體積小，溫度效應忽略不計。服從均勻分布，，10 mL容量瓶由此引入的標準不確定度為50 mL容量瓶由此引入的標準不確定度為10 mL容量瓶引入的相對標準不確定度為容量瓶引入的相對標準不確定度為標準溶液配制過程中量器引入的相對標準不確定度計算為：

3.4.2 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度u4(c)

使用糖精鈉標準溶液逐級稀釋，配制標準工作液，利用線性最小二乘法擬合曲線。根據式（2）～式（4）計算樣品溶液的相對標準不確定度u4(c)。標準工作溶液測定結果見表3，標準工作曲線的線性方程及統計結果見表4。

式（2）～（4）中：SR為殘差標準偏差；CX為待測樣品溶液濃度的平均值，mg·L-1；b為斜率；a為截距；P為樣品測定次數；n為測試標準曲線次數；CP為標準曲線各點濃度的平均值，mg·L-1；Sxx為離均差平方和；Ci為標準曲線各點濃度，mg·L-1；Ai為標準曲線各點對應的峰面積。

根據表3、表4中的數據，計算得出標準曲線擬合引入的相對標準不確定度u4(c)=0.053 3。

表3 標準工作溶液測定結果表

表4 標準工作曲線的線性方程及統計結果表

3.5 合成相對標準不確定度urel(x)

樣品中糖精鈉測定結果相對合成不確定度為：

3.6 擴展不確定度的評定和結果報告

取置信區間p=95%，包含因子k=2，則香烤瓜子中的糖精鈉含量測定的相對擴展不確定度為Urel=k×urel(x)=2×0.059 4=11.88%。

該實驗測得樣品中糖精鈉含量均值為1.583 g·kg-1，因此擴展不確定度U=1.583 g·kg-1×11.88%=0.188 g·kg-1，高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉含量的最終結果表示為X=(1.583±0.188) g·kg-1，k=2。

4 結論

本實驗討論了高效液相色譜法測定香烤瓜子中糖精鈉含量不確定度的主要來源及各不確定度分量的評定方法，通過評定過程可知，樣品稱量、樣品溶液定容、重復性測量對分析結果的不確定度影響相對較小。本實驗主要的不確定度來自標準曲線引入的B類不確定度。其中，標準曲線引入的不確定度主要來源于標準曲線的溶液配制和標準曲線的擬合。對標準曲線溶液配制不確定度影響較大的為量器引入的不確定度，檢測過程中應盡量選擇精度較高的量器，同時注重量器的維護保養，保持量器干燥潔凈，并定期進行檢定。單次測量引入的隨機誤差對標準曲線擬合產生的不確定度貢獻較大。因此，在日常檢驗過程中為減少隨機誤差，提高測定結果的準確性，可增加標準曲線各點的測定次數。