STAT3、NCK1 和VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義

李佳楠，陳春悠

（1.華北理工大學口腔醫學院，河北 唐山 063000；2.唐山市工人醫院頭頸外科，河北 唐山 063000）

對于手術難以根除的難治型甲狀腺癌，積極尋找特異性高、靈敏度強的分子標記物是十分必要的。STAT3 屬于信號轉導和轉錄活化因子（signal transducer and activators of transcription，STATs）家族成員，作為原癌基因可以加速癌細胞增殖，延緩癌細胞凋亡，幫助癌細胞逃脫免疫識別，誘導腫瘤血管生成并參與惡性腫瘤的侵襲和轉移過程。非催化區域酪氨酸激酶1（non-catalytic region of the tyrosine kinase adaptor protein 1，NCK1）是一種信號內接頭蛋白，參與細胞骨架重構，并與惡性腫瘤的侵襲和轉移等過程密切相關。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）不僅參與腫瘤微血管的生成過程，還參與惡性腫瘤淋巴管生成等過程。本研究主要STAT3、NCK1、VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平、相關性以及與甲狀腺臨床病理特征之間的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 收集2019 年9 月-2020 年12 月唐山市工人醫院頭頸外科病理診斷明確的甲狀腺乳頭狀癌組織63 例、甲狀腺腺瘤組織32 例、正常甲狀腺組織（選取距離腫瘤病灶大于2 cm，經病理證實無異常的甲狀腺組織）20 例。所有病例臨床資料完整，病理診斷明確，且取材前無其他頭頸部腫瘤史及放化療史，均為第1 次接受甲狀腺外科手術。

1.1.2 實驗試劑 兔抗人STAT3 多克隆抗體、兔抗人NCK1 多克隆抗體、兔抗人VEGF 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB 試劑盒、PV6000 通用型試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法 采用免疫組化SP 法染色，具體實驗操作步驟按試劑說明書操作。陽性對照以試劑公司提供的陽性切片作為標準，陰性對照以PBS 液代替一抗作為標準。

1.3 結果判讀 STAT3、NCK1 的表達主要定位于細胞質，其次為細胞核；VEGF 的表達定位于細胞質，表現為彌散的顆粒狀染色。采用雙盲法由2 名病理科醫生在400 倍高倍鏡下隨機選取5 個不少于100個細胞的視野，取其平均值。評判標準[1]：陰性（-）：基本無著色；弱陽性（+）：≤10%的細胞呈現不同程度的細胞質著色；陽性（++）：10%～30%的細胞呈現強的棕褐著色的細胞質著色，或≤70%的細胞呈現弱或中等強度的細胞質著色；強陽性（+++）：＞30%的細胞呈現強的棕褐著色的細胞質著色或＞70%的中等強度細胞質著色。

1.4 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理，對實驗結果進行統計分析。計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；采用Spearman秩相關性分析甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達的關系。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達情況比較 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達率高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；而甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同甲狀腺組織中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達情況比較[n（%）]

2.2 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關系 STAT3 陽性表達與腫瘤直徑、是否伴有頸部淋巴結轉移相關（P＜0.05），而與性別、年齡、病灶數、是否侵犯甲狀腺外被膜、是否合并橋本甲狀腺炎無關（P＞0.05）；NCK1 陽性表達與是否伴有頸部淋巴結轉移相關（P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤直徑、病灶數、是否侵犯甲狀腺外被膜、是否合并橋本甲狀腺炎無關（P＞0.05）；VEGF 陽性表達與腫瘤直徑、是否侵犯甲狀腺外被膜和是否伴有頸部淋巴結轉移相關（P＜0.05），而與性別、年齡、病灶數、是否合并橋本甲狀腺炎無關（P＞0.05），見表2。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關系[n（%）]

表2（續）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白表達的相關性分析 甲狀腺乳頭狀癌中STAT3 與NCK1 的表達呈正相關（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 與VEGF 的表達呈正相關（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 與VEGF 的表達呈正相關（r=0.477，P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的生長發育過程中往往由于空間有限而伴隨著缺氧、高壓、高滲等環境，在這種惡劣環境中，腫瘤微血管生成和抑制的平衡關系被打破，癌細胞內各種調節血管內皮生長的基因開始表達并參與到腫瘤微血管生成的過程中，為腫瘤提供血液和氧氣，使得腫瘤體積不斷增大。同時，腫瘤微血管生成也是惡性腫瘤侵襲和轉移行為的基礎[2，3]。腫瘤微血管的形成與惡性腫瘤的不良生物學行為和預后直接相關，因此研究腫瘤微血管生成的相關調節因子，以及其可能存在的作用機制對于患者預后的評估和未來腫瘤治療靶點的探索有著積極意義。

VEGF 在腫瘤血管生成的過程中扮演著不可或缺的角色。頭頸部腫瘤，如下咽癌[4]、口腔癌[5]、甲狀腺癌[6]，因其生長空間有限，使得局部缺氧環境更加容易形成，最終造成腫瘤微血管的形成。在目前已知的腫瘤微血管形成的過程中，腫瘤血管內皮細胞通過自分泌和旁分泌VEGF，進而參與誘導腫瘤內部形成新生微血管，并造成血管內皮生長和抑制的失衡。此外，新生微血管的形成造成腫瘤內部微環境改變，形成缺氧環境，缺氧誘導因子活化后使得VEGF 的轉錄程度進一步增強，加劇了腫瘤微血管的生成，從而使得腫瘤不斷獲取養分而生長發育[7]。VEGF 不僅參與調控腫瘤微血管的生成過程，還參與腫瘤的轉移過程。同時，VEGF 可以協同VEGF-C通過直接和間接的方式促進腫瘤細胞通過微淋巴管轉移至全身。另外，VEGF 通過增加淋巴管上皮的通透性和改變細胞粘附性等手段促進惡性腫瘤通過淋巴管轉移，參與其轉移過程[8，9]。NCK1 定位于人的染色體3q22.3，位于細胞質中，是一種信號轉導和轉化蛋白。NCK1 具有Src 同源性2 和3 結構域，即SH2和SH3 結構域，而SH2 和SH3 結構域也賦予了NCK1 參與細胞骨架重構、細胞分裂增殖和遷移過程的能力[10-12]。Morris DC 等[13]研究發現，NCK1 作為原癌基因可以促進乳腺癌的侵襲和肺轉移等過程，當NCK1 被抑制表達時，乳腺癌細胞的侵襲性降低。Xia P 等[14]通過免疫組化、Western blot、ELISA 檢測等手段證實了NCK1 參與調節宮頸鱗癌微血管生成的過程，其通過上調VEGF 的表達，從而誘導宮頸癌腫瘤微血管的形成，使腫瘤侵襲和轉移行為獲得養分支持。STATs 家族存在于細胞漿中，是一類具有信號轉導和轉錄調控功能的蛋白家族。STAT3 作為原癌基因，在正常組織中的激活受到嚴格把控，而在惡性腫瘤中，STAT3 持續的激活可以誘導Bcl-2、c-Myc 和Bcl-XL 過度表達，導致腫瘤細胞持續增殖，也可以參與腫瘤細胞逃避免疫識別、促進血管生成過程中關鍵基因的轉錄[15，16]。伍婧等[17]研究發現，結腸癌中STAT3 與VEGF 的表達明顯升高，且與結腸癌的血管生成密切相關。

本研究通過免疫組化法檢測并比較了STAT3、NCK1、VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織中的表達水平，結果發現甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 陽性表達率高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05），提示三者可以作為鑒別不典型甲狀腺良惡性腫瘤的指標。通過對甲狀腺乳頭狀癌中STAT3、NCK1、VEGF 蛋白與臨床病理的關系進行分析，結果發現甲狀腺乳頭狀癌中腫瘤直徑越大，STAT3 和VEGF 的表達越顯著，說明二者參與了甲狀腺乳頭狀癌的生長發育過程中，并在其過程中起到了促進作用。而VEGF 的表達情況還與癌灶是否侵犯甲狀腺外被膜相關，表明VEGF 與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲性密切相關，隨著甲狀腺癌的不斷進展，VEGF 的表達水平不斷升高，最終導致癌灶向外侵襲，并突破被膜侵犯周圍肌肉和神經組織。此外，STAT3、NCK1、VEGF 均與甲狀腺乳頭狀癌患者的頸部淋巴結轉移密切相關，提示三者均參與了甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結轉移的過程，檢測三者的表達水平對鑒別患者是否發生頸部淋巴結轉移有重要意義。甲狀腺癌多來源于甲狀腺濾泡上皮惡變，在惡變的過程中伴隨著血管生成和抑制功能的失調，其中異常表達的VEGF 在誘導腫瘤新生血管形成的過程中起到了關鍵作用[18，19]。Zhang F 等[20]研究發現，在結直腸癌中NCK1 是STAT3 的一個下游信號分子，在STAT3 的調控下，NCK1 高表達并且參與促進了結直腸癌血管生成過程。本研究結果發現，甲狀腺乳頭狀癌中STAT3 與NCK1 的表達呈正相關（r=0.483，P＜0.05）；STAT3 與VEGF 的表達呈正相關（r=0.584，P＜0.05）；NCK1 與VEGF 的表達呈正相關（r=0.477，P＜0.05），提示在甲狀腺癌進展過程中STAT3、NCK1、VEGF 的表達同樣存在較強的相關性，由此可以推斷，STAT3 和NCK1 作為癌基因相互作用，可以誘導VEGF 表達，促使腫瘤微血管形成；同時三者還可通過協同作用，以直接或間接的方式促使甲狀腺乳頭狀癌通過淋巴管向頸部轉移，導致患者不良預后。

綜上所述，STAT3、NCK1 與VEGF 三者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平高于甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺組織，可為臨床鑒別不典型甲狀腺良惡性腫瘤提供思路。此外，STAT3 和NCK1 不僅能誘導VEGF的表達，促進腫瘤血管生成，三者還可協同參與甲狀腺乳頭狀癌的生長發育，侵犯甲狀腺外被膜和頸部淋巴結轉移過程。