中華蟾蜍靜止代謝率與高耗能器官大小的關系

楊巧，譚松，張月嬋，傅金鐘，陳競峰

(1.中國科學院成都生物研究所，成都610041；2.中國科學院大學，北京100049；3.圭爾夫大學，圭爾夫ON N1G 2W1，加拿大)

靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)是指動物維持生理穩態的最低能量消耗(Biro & Stamps，2008；孫儒泳等，2019)。在內溫動物和外溫動物中，RMR分別指代的是基礎代謝率(basal metabolic rate，BMR)和標準代謝率(standard metabolic rate，SMR)，即成年動物處于非繁殖、靜止和消化吸收后的狀態時，在熱中區(內溫動物)或特定溫度(外溫動物)測得的最低代謝速率。無論外溫動物或內溫動物，RMR在個體、種群或物種水平上都存在顯著差異，且與生長、存活等適合度成分關聯密切(Biro & Stamps，2010；Auer.，2015；Pettersen.，2016；Arnold.，2021)。因而探究這些差異的形態、行為、生活史、系統發育方面的原因一直是動物生理生態學、進化生理學的研究重點。

RMR應該與心臟、肝臟、腎臟、小腸等高耗能器官的質量顯著正相關(Daan.，1990；Hammond & Diamond，1997；Koteja，2000；Ksiazek.，2009)。代謝能力更強的有機體可以負荷更高的持續能量支出(如每日能量支出、持續代謝率或者最大代謝率)，但它們同時須承受更高的維持代價(即RMR)(Careau.，2008)。按照形態功能適應的原則，更高的持續能量支出需要更強大的高耗能器官(主要用于食物同化過程)與之匹配(又稱“攝食增量假說”)。這個假說預測，在相關選擇作用下，更大的高耗能器官需要更高的RMR以維持其基礎運行。該預測在內溫動物中得到較普遍的支持。盡管小鼠的小腸、肝臟、腎臟和心臟總重只占體質量的17%，但卻貢獻了個體間RMR 52%的差異(Konarzewski & Diamond，1995；Ksiazek.，2004)。此外，人工選擇BMR更高或食物攝入量更多的小鼠品系會導致小腸、肝臟、腎臟和心臟的比重增加(Selman.，2001；Ksiazek.，2004)?？鄢w質量的效應，布氏田鼠的BMR和心臟、肝臟、腎臟以及盲腸干重顯著正相關(Song & Wang，2006)。在 22種鳥類中，心臟和腎臟的組合相對質量也解釋了其BMR 50%的變化(Daan.，1990)。然而，該假說很少在外溫脊椎動物研究中進行驗證，已有的少數研究結論也不一致(Biro & Stamps，2010)。

與器官形態特征不同，生理特征具有較強的可塑性。一般認為RMR的可重復性為0.3～0.4。因此，單次測定往往會與其真實值有較大偏離(Careau & Garland，2015)。進化生理學家極力主張采用重復測量的研究范式，結合隨機回歸模型分解生理特征的個體間和個體內方差及其相關性(Roche.，2016；Careau，2017)。然而，在過往RMR與器官大小的研究中，還未見該實驗設計和統計方法的應用。

中華蟾蜍是東亞地區演化最為成功的兩棲類之一，分布在20°～50°N，海拔分布從太平洋島嶼延伸至青藏高原(Zhan & Fu，2011；Lu.，2021)。在外溫脊椎動物中具有較強的代表性。本研究擬從野外采集中華蟾蜍成年個體，重復測定RMR 3次，利用馬爾可夫-蒙泰卡羅雙變量混合線性模型(MCMCglmm)(Hadfield，2010)，探究RMR和高耗能器官相對質量的個體間相關性。預測扣除體質量影響后，中華蟾蜍的RMR和小腸、肝臟、腎臟和心臟正相關，支持“攝食增量假說”。

1 研究方法

1.1 實驗動物

成年中華蟾蜍為在繁殖季節采自川西山區多個海拔樣點(雄性27只，雌性19只)。動物捕獲后運送至中國科學院成都生物研究所動物房飼養。動物房內溫度控制在20 ℃±1 ℃，光周期設定為12 h∶12 h(08∶00—20∶00開燈)。動物單籠飼養在長35.5 cm×寬25 cm×高15 cm的塑料盒內，盒內放置1塊濕潤的海綿提供水分，以及1塊U形瓦片用于躲藏。飼喂蟾蜍的主要食物是沾有鈣粉(Exo Terra)的黃粉蟲，每 2 d喂食1次。此外，每周給蟾蜍飼喂蟋蟀1次(2～3只)。所有蟾蜍均在實驗室馴化3個月以上。所有動物操作均按照中國科學院成都生物研究所動物福利委員會的要求執行。

1.2 呼吸代謝測定

RMR采用開放式呼吸代謝儀(TSE Systems，德國)在21 ℃環境下測定(Tan.，2021)。代謝測定前后均測量動物體質量(精確到0.1 g)。實驗測定前，動物被轉移到900 mL的亞力克材質的圓柱形呼吸室中適應2 h。呼吸室內均放置10 cm×10 cm濕紙巾以防止動物在測定過程中脫水。代謝測定時，首先利用氣體流速控制器(G246)將壓縮空氣的氣體流速控制在200 mL·min。然后，氣流開關(G244)將穿過呼吸室的氣流與高氯酸錳的干燥柱連接(去除其中的水汽)，再將干燥過的氣流導入O和CO分析裝置中(S104氧氣分析儀和QS151氧氣分析儀)。因為中華蟾蜍為夜行性動物，選擇在20∶30—06∶30測定RMR。代謝儀每批測定5只動物，每次耗時5 h。所有個體測定重復3次，每次測定個體的順序保持一致。實驗數據使用TSE Systems配備的專用軟件進行采集。RMR以測定期內5 min內連續、最低耗氧速率的平均值計算。同時計算呼吸熵(CO生成和O消耗的比例)用于推斷其有氧代謝的底物利用狀態(Withers，2001)。

1.3 器官形態測定

代謝測定結束后，采用MS222(0.2%M/V)深度麻醉中華蟾蜍(鑷子夾擠后腿肌肉無條件反射)。隨即分離各內臟器官(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、性腺)和胴體，并將各器官間的結締組織剝離干凈。消化道用清水清理內容物后，分割成大腸、小腸和胃。各器官用濾紙吸干水分后，用鋁箔紙包裹放置于干燥箱中，在65 ℃下干燥直至質量不再變化。

1.4 統計分析

數據采用SPSS 21.0和R 4.0.3進行分析。胴體干重和RMR均采用對數轉換使其符合正態分布(Shapiro-Wilk檢驗)。采用一般線性模型分析性別和總干重(待分析的目標器官沒有被包括在總干重中)對各器官干重的影響，其中固定效應包括性別、總干重、性別和總干重的交互作用。單變量混合線性模型用于分析重復測定的SMR和呼吸熵，固定效應設置為性別、總干重、性別和總干重的交互作用，個體標簽設定為隨機效應。隨機效應的顯著性基于最大似然法進行檢驗。

2 實驗結果

2.1 中華蟾蜍各器官相對干重的性別差異

中華蟾蜍雌雄個體存在二型性，雌性各器官的絕對干重均大于雄性(圖1：A)。除去體質量影響后，雌性的脾臟、腎臟干重顯著大于雄性(<0.05)，雄性的心臟、肺臟干重顯著大于雌性(<0.05)，而肝臟、胃、小腸、大腸、消化道和胴體的性別間差異不顯著(>0.05；圖1：B；表1)。

表1 一般線性模型分析性別和總干重(不包含因變量器官)對中華蟾蜍各器官干重的影響

圖1 中華蟾蜍各器官絕對干重(A)和用干體質量校正后的相對干重(B)

2.2 性別和體質量對RMR的影響及其可重復性

總干重顯著影響RMR(<0.001)，但對性別和重復測定的時序沒有影響(>0.05；表2；圖2)。呼吸熵也不受性別和重復測定的時序影響(>0.05；表2)。RMR和呼吸熵的重復性分別為0.321和0.201。

表2 單變量混合線性模型分析中華蟾蜍靜止代謝率和呼吸熵

圖2 中華蟾蜍靜止代謝率與總干重的關系(A)及重復測定(B)

2.3 器官干重與RMR的相關性

MCMCglmm分析結果顯示，在個體水平上，總干重校正的RMR和器官大小都無顯著相關性(>0.05；表3；圖3)。

圖3 中華蟾蜍靜止代謝率殘差與各器官質量殘差的相關性

表3 MCMCglmm雙變量混合線性模型分析中華蟾蜍靜止代謝率和各器官在個體間水平的相關關系

3 討論

中華蟾蜍的高耗能器官質量與RMR不存在相關性：1)在該物種中，RMR和持續能量支出間可能不存在相關選擇或其選擇壓力較小。無論外溫動物還是內溫動物，種間比較都支持持續能量支出和RMR顯著正相關(Taigen，1983；Bozinovic，1992；Merritt.，2013)。然而，種內分析二者相關性往往出現不一致的結果。例如，在個體水平上，根田鼠和高原鼠兔夏季的BMR與最大代謝率并不相關，而冬季根田鼠BMR與最大代謝率顯著相關(=0.612)(王玉山等，2002)；花園石龍子的RMR和最大代謝率不相關(Merritt.，2013)；在福勒蟾蜍中二者雖然相關，但相關系數僅為0.37(Walton，1988)。因而，何種生態、進化及生活史因素可以影響RMR和持續能量支出的關聯性值得進一步研究。2)在該物種中，持續能量支出的個體差異不是由高耗能器官的質量大小變異來貢獻的。在美洲豹蛙中，僅見RMR和腎臟干重殘差顯著正相關，而與心臟、肝臟、小腸和腓腸肌干重不相關(Steyermark.，2005)。然而，該相關性受單一數據奇值點影響。這說明，即便是用腎臟來解釋RMR的個體間變異，也存在較大的不確定性。在安第斯蟾蜍中發現，具有更高RMR的個體擁有更大的小腸、肝臟、腎臟和心臟(Naya.，2009)，但該研究將冬眠組、短期禁食組和對照組樣本合并進行了關聯分析。而冬眠、短期禁食處理可能消耗高耗能器官中的脂肪等低代謝身體成分，潛在地增加了數據的極化程度，進而導致器官質量與RMR相關。因此，利用高耗能器官的大小來闡釋持續能量支出的個體差異在兩棲類中可能并不具有普遍性。將來的研究有必要聚焦于高耗能器官的生理生化特征(如檸檬酸循環或電子呼吸傳遞鏈過程中的限速酶)，來闡釋高耗能器官與RMR的關聯性(Bozinovic，1992；Trzcionka.，2008；Koch.，2021)。

本研究結果也證實，在開展整體生理學特征相關性研究時，進行重復測量設計的必要性。中華蟾蜍的RMR重復性僅為0.321，許多個體在3次測定過程中的RMR出現大幅度波動。如果僅依據單次測定結果進行相關分析，必然會偏離其真實值。實際上，利用單(多)變量隨機回歸模型分析重復測量的數據集可以解析何種因子限制特征穩定性、可塑性、進化權衡等一系列有趣的進化和生態問題，且日益受到學界關注和重視(Dingemanse & Dochtermann，2013；Sih.，2015；Videlier.，2019)。因此建議國內動物生理生態學者們在采用非入侵性生理學指標測定時充分利用這一設計理念。

本研究采用的動物來自不同海拔位點，而不同海拔的持續能量支出、RMR和體質量的尺度關系可能存在差異，從而影響器官大小與RMR的關系。然而，前期研究發現不同海拔中華蟾蜍的RMR沒有差異，而且其與體質量的尺度關系也不隨海拔變化(Tan.，2021)。而且，這些動物經過較長時間的室內馴化，很大程度上抵消了采用前即時環境的影響。因此，理論上來說，多個海拔位點取樣不會對本研究結果產生顯著影響。

本研究發現，中華蟾蜍的高耗能器官大小與其RMR不相關，提示該物種的持續能量支出與其高耗能器官質量不相關，或者持續能量支出與RMR不相關，因而不支持“攝食增量假說”。該研究為擴展外溫動物持續能量支出理論奠定了實驗基礎。