不同性狀脂肪脫細胞基質的制備及研究進展

胡鈺玲 祁佐良

【提要】 近年來，組織工程作為一種新興的治療手段在整形和修復重建中的應用越來越受到臨床和基礎研究的重視。然而，目前常見的支架存在可塑性低或生物相容性差等缺點，尋求一種理想的支架材料仍是目前研究的熱點和難點。脂肪組織脫細胞外基質（Decellularized adipose tissue，DAT）是指脂肪組織通過一系列脫細胞處理后得到的無細胞提取物，可模擬天然脂肪細胞外基質的特性，具有良好的生物相容性及可調節性，有望作為新型的組織工程支架應用于整形和修復重建等領域。本文將從DAT 的特點、不同性狀脫細胞基質的制備方法及研究進展等方面進行綜述。

支架作為組織工程最主要的組成之一，不僅可以為細胞和生長因子提供載體，還可以對細胞的黏附、增殖、分化等起到重要的調節作用。目前，應用廣泛的支架主要分為兩類，一是人工合成的高分子支架，如聚乳酸及聚乳酸聚乙醇酸共聚物等；二是天然的生物類支架，如透明質酸、膠原蛋白[1]、殼聚糖等[2]。前者生物相容性差，降解產物易使人體產生炎癥反應，進而導致纖維包裹或表面皮膚潰瘍等不良后果，且合成的高分子支架制備工藝復雜，需通過交聯等手段添加生長因子或蛋白質以進一步實現生物功能。后者雖有著良好的生物相容性和可降解性，但機械性能差且難以進一步通過化學手段改性。因此，尋找一種新型組織工程支架是目前相關研究的熱點和難點。脂肪組織脫細胞外基質（Decellularized adipose tissue，DAT）作為天然的組織成分，被認為有著良好的生化特性，是新型生物支架的理想材料。本文聚焦于DAT 近幾年來的研究，對DAT 的特點和不同性狀脫細胞基質的制備方法及研究進展等進行綜述。

1 脂肪脫細胞基質的特點

脂肪組織作為人體重要的構成部分，在人體廣泛分布，來源豐富，獲取方便，臨床上吸脂手術后丟棄的脂肪組織更是脂肪脫細胞基質的豐富來源。脂肪組織在經過反復的物理、化學或酶處理后，可有效去除含免疫原性的細胞成分，故具有較好的生物相容性，即使異體移植也幾乎不會產生組織排斥和過敏反應[3-4]。此外，DAT 支架保留了細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）所擁有的天然結構及膠原蛋白、層粘連蛋白和生長因子等重要生物活性成分，相較于其他合成的高分子支架，更能模擬天然的組織微環境，且無需人為添加外源性生長因子[5]。已有研究表明，DAT 不僅可以為細胞生長提供良好的支持結構和空間，還可以通過黏附、招募宿主的干細胞促進脂肪和血管生成，相較于單純的脂肪組織移植，混合應用同種異體脂肪的基質進行軟組織重建可以獲得更好的體積保留率[3，6-8]。同時，DAT 支架適應力和可調節性極強，可以被制備成粉末、水凝膠、薄片等不同的物理形態和體積，或通過特殊手段改變其生物或物理性狀，從而滿足臨床的多種需求，是一種極具潛力的組織工程支架。

2 脫細胞基質的制備

ECM 作為脂肪組織的重要結構，具有良好的孔隙結構，且對細胞行為的調節具有關鍵作用[9-10]。理想的脫細胞技術是指在脂肪ECM 的基礎上進一步去除所有細胞成分，在減少機體免疫排斥反應的同時保留原始ECM 的結構和組成完好無損。目前常用的脫細胞基質的制備方法包括以下幾類。

2.1 物理法

脂肪組織通過反復的凍融循環、高速攪拌、機械切碎或研磨等方法可以有效破壞細胞結構，溶解細胞。在低溫中操作有助于保持DAT 支架的生物活性，使之在均質化的同時不會對DAT 的微觀結構和天然膠原纖維造成破壞。在制備過程中冷凍的溫度、DAT 溶液濃度和研磨時間等，均會對產物的性狀產生不同影響。較高的冷凍溫度和較低的DAT 濃度可提高支架的孔隙率并降低其黏度，而較低的溫度則會使支架產生較小的孔徑，這可能與加工過程中形成的冰晶大小有關[11-12]。研究表明，種子細胞的空間分布依賴于支架的孔徑大小，孔徑大的支架能允許更多的營養物質和氧氣通過，細胞黏附力和分化能力通常較好，細胞分布也更為均勻，適合細胞生長的三維支架孔徑一般為50～400 μm[13-14]。此外，DAT顆粒的尺寸可以通過增加或減少研磨時間來控制，增加研磨時間往往能獲得更小尺寸的DAT 顆粒，而相較于大尺寸的DAT 顆粒，較小尺寸的DAT 顆粒和較高密度的種子細胞被認為更能刺激脂肪細胞的再生[15]。

2.2 化學法

一些低滲或高滲的溶液可以通過其滲透壓導致細胞裂解，破壞DNA 和蛋白質之間的相互作用，但難以徹底清楚殘余的細胞碎片[16]。為了進一步去除ECM 中的脂質和細胞碎片，通常需用化學洗滌劑進行清洗。這些洗滌劑大致分為離子型洗滌劑和非離子型洗滌劑兩類。前者包含月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉和脫氧膽酸鈉等，具有破壞蛋白質和蛋白質之間相互作用的能力，可用來進一步破壞細胞膜，但可能會產生蛋白質變性等不良結果，且后期難以徹底去除[5]。后者主要是指Triton X-100，是組織去細胞化中應用最廣泛的非離子洗滌劑，可以干擾脂質和蛋白質之間的相互作用，去除殘留的脂質，對組織影響溫和，有助于保持組織的原始結構和組成完整[17-18]。然而，再溫和的洗滌劑成分也不可避免地會對基質成分產生破壞，特別是十二烷基硫酸鈉已被證明可以與ECM 相互作用，改變其結構并顯著影響細胞的活性[19-20]。Morissette 等[11]于2018 年首創了一種無洗滌劑的脫細胞方式，既保持了脂肪ECM 的復雜結構和組成，又避免了殘留洗滌劑的相關細胞毒性，并能以凍干形式長期儲存。此外，應用異丙醇、乙醇、磷酸三丁酯或酸堿等有機溶劑進行極性萃取，也可以進一步溶解細胞的細胞質成分，去除多余脂質[8，18，21]。

2.3 生物酶消化法

目前常用的消化酶有脂肪酶、蛋白水解酶、核酸酶等。脂肪酶可用于去除DAT 中的殘留脂質，但效率不及異丙醇[17，22]。胰蛋白酶作為最常用的蛋白水解酶通常與螯合劑乙二胺四乙酸合用，以進一步分解細胞膜蛋白[23]。胰蛋白酶的特異性高，易被血清中和，長時間孵育能更有效去除細胞成分，不易造成殘留，但也會在一定程度上破壞ECM，故需嚴格控制其作用時間[24]。核酸酶，如脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶，則能作用于磷酸二酯鍵，水解細胞中的核苷酸，達到降低產物免疫原性的作用，在去細胞化的過程中被常規使用[25-26]。

目前所報道的脫細胞方案均步驟繁瑣，且差異巨大。不同的去細胞方案可以顯著影響脫細胞基質的結構和生化特性，如何簡化脫細胞方案并有目的性地控制DAT 的性能，使其能特異性地應用于臨床，仍是目前亟需解決的難題和挑戰。

3 不同性狀脂肪脫細胞基質的研究進展

3.1 粉末狀/顆粒狀

Choi 等[27]將組織經均質化、離心、冷凍干燥、研磨等操作后制備得到粉末狀DAT。粉末狀DAT 可作為可注射支架通過細針注射，減少了侵入性外科手術的需求，以最大限度地減少患者在進行軟組織缺損治療時產生的不適和感染、瘢痕形成等不良風險，減輕患者的經濟和精神負擔。其特殊的疏松質地和多孔結構極大增加了支架的表面積，有利于脂肪干細胞的黏附和生長。將脂肪干細胞接種在粉末狀DAT 上注射入裸鼠體內8 周后，可觀察到周圍血管生成及細胞內的脂滴聚集，且支架無明顯吸收，證實了粉末狀DAT 在體內能成功構建出成熟的脂肪組織[28]。

3.2 片狀/泡沫狀

與粉末狀/顆粒狀不同，片狀/泡沫狀DAT 是具有二維或三維立體結構的支架。將DAT 澆鑄在表面模具中冷凍干燥即可得到片狀DAT[29]。該支架能與人成纖維細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞、臍靜脈內皮細胞和脂肪干細胞成功整合，有望用于局部組織缺陷或損傷的治療[30]。Lee 等[31]使用DAT 片作為敷料，治療大鼠背部的全層皮膚傷口，結果顯示傷口愈合率、上皮形成率和微血管密度均顯著高于普通傷口敷料。由殼聚糖膜和DAT 薄片組成的雙層復合敷料不但可以誘導肉芽組織和表皮的再生，減少瘢痕形成，并具有優異的抗菌能力[32]。此外，Dunne 等[33]利用圓片狀DAT 在體外建立了3D 環境下的乳腺癌細胞模型，為研究乳腺癌細胞的生長、遷移/侵襲、形態和藥物反應提供了更好的仿生環境。與片狀支架相比，泡沫狀支架更側重于提供一種三維結構。Yu 等[12]使用α淀粉酶酶酶解DAT，并通過冷凍干燥后在模具內溶解的技術和電噴霧兩種方式來制備疏松多孔的DAT 泡沫，作為軟組織再生和傷口愈合的生物支架。得益于特殊的3D 結構，DAT泡沫可以支持宿主細胞的快速浸潤，加快支架重塑和再吸收，使支架能更好地整合到宿主組織中，達到促進血管和脂肪生成的目的。泡沫狀DAT 的適應性強，可以根據所選的特定模具制造成各種幾何形狀。相較于原始的DAT，高度加工后的DAT 泡沫可以更有效地誘導體內的血管生成，但同時加快了其再宿主體內的降解速率，12 周便可被完全吸收[34]。

3.3 水凝膠

水凝膠具有高度多孔的結構和可調節性，在軟組織工程化構建中備受關注，粉末狀或顆粒狀的DAT 可經胃蛋白酶消化，或進一步與聚合物載體結合形成可注射的復合凝膠[35-36]。在小鼠體內注射DAT 水凝膠后，無論是否種植了脂肪干細胞，自第2 周開始都可以觀察到脂肪生成的趨勢，且隨著時間的推移，該趨勢更加明顯[10]。研究發現，DAT 中所含的Ⅰ型膠原蛋白在合適的pH 和溫度下可以聚合形成水凝膠網，寡聚氨酯的加入可以適當地誘導這種聚合，提高植入物的體積保留率，保持細胞活力并阻止成纖維細胞誘導的收縮[37]。Tan等[38]發現，與聚N-異丙基丙烯酰胺混合制備的水凝膠具有熱敏性，可在體溫下自組裝。Jeon 等[39]進一步證明了將聚N-異丙基丙烯酰胺和貽貝黏合蛋白摻入DAT 水凝膠中，可以靶向地向組織缺損部位遞送包封的干細胞，達到長期促進血管形成和脂肪誘導的作用。此外，DAT 水凝膠還可通過注射，用于增強癱瘓聲帶的聲功能[40]，或顯著增強股骨缺損小鼠的體內骨再生[41]。

4 結論與展望

近年來，天然衍生的生物材料在一系列組織工程應用中均顯示出巨大的前景。對于整形和修復重建等領域而言，一種可定向設計性狀的工程化的軟組織替代物具有重要價值。研究表明，軟組織填充物的機械性能尤為重要，顯著影響種子細胞的生物學反應[42]。在理想狀態下，軟組織填充物應該柔韌、富有彈性，能模擬周圍的天然組織，以最大限度地適應機體環境，減少炎癥和瘢痕形成。

去細胞化的脂肪組織具有保存完好的三維結構和機械性能，與天然組織具有高度相似性，生物相容性好，能為脂肪干細胞的脂肪性分化提供良好微環境，在組織工程及大體積的軟組織重建中有著極大的應用潛力。基因和蛋白質研究表明，DAT 可以增強PPARγ 和CEBPα 等脂肪生成的主要調控基因和蛋白質標志物的表達，而無需額外添加外源性因子[23]。同時，DAT 所含的一些天然組分，如層粘連蛋白和纖連蛋白等，也早已被證實在器官發生和傷口愈合過程中起著至關重要的作用，為軟組織缺陷、皮膚傷口愈合、骨骼缺損等多種臨床疾病的治療提供了新的思路。除了在體內臨床應用外，DAT 在體外研究中也有潛在的用途。DAT 的仿生特性使其能夠非常接近地模擬體內微環境，是一種理想的三維細胞培養系統，可用于干細胞的體外培養，為生理學和疾病的研究提供支持。此外，DAT 支架具有強大的適應性和可調控性，除了其本身固有的生化組成和結構外，將原始DAT 進一步交聯聚合不僅可以調控支架的降解速率，還可以使其獲得更優良的力學特性和生物學特性，降低免疫反應，提高對酶的抵抗性，更好地模擬天然脂肪組織[7，43-45]。生物材料的特性對脂肪組織工程至關重要，如何有目的性地選擇交聯劑以優化DAT，以及改性后的DAT 支架在體內是否具備穩定性和安全性，仍需進一步研究。近年來，3D 打印技術的出現使DAT 支架的三維結構更加多樣化。Pati 等[46]開發了一種基于DAT 的新型生物墨水，可將種子細胞預先封裝于其中，用于在體外打印出具有脂肪生成或軟骨生成潛力的組織類似物。與3D打印技術聯合應用可以有目的地操控DAT 支架，使之具有特定形狀和結構，從而促進特定組織類型的形成，也可用于制作高保真的體外模型，用于細胞生物學、人體生理學或疾病病理學的研究。

目前所報道的這些脫細胞方案仍不成熟，操作流程繁瑣，成本高產量低，且制備過程中不可避免地需要用到一些對機體有刺激性的溶液，無法大規模應用于工業化生產和臨床。如何優化脫細胞策略，使其能在最短的處理時間內最大程度地減少ECM 的宏觀變化，確保支架的長期穩定性和低免疫原性，是現階段研究的一大難點。另外，不同報道所采用的脫細胞方式均有不同，導致制備的DAT 組分及性狀也差異巨大。要實現DAT 工業化生產和大規模臨床應用，當務之急是標準化脫細胞化流程，建立DAT 的規范化評價標準。若能克服上述難點與挑戰，在未來我們有望根據宿主組織特定的物理和生化特性設計出特異性的DAT 支架，為整形和修復重建領域的發展開辟新的途徑。