脂肪干細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡提高脂肪移植存活率的研究進(jìn)展

劉軒辰 李潔 馬繼光

脂肪組織是理想的軟組織填充材料，目前廣泛應(yīng)用于美容填充、組織重建和瘢痕治療等領(lǐng)域[1-5]，提高移植脂肪的存活率是相關(guān)研究的熱點(diǎn)問題。已有研究表明，向脂肪移植物中添加基質(zhì)血管成分[6]、脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cell,ADSCs）[7]、ADSCs 分泌的細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）[8]、富血小板血漿[9]、細(xì)胞因子[10]等，都可提高移植脂肪的存活率。其中，EVs 是近年來的研究熱點(diǎn)。本文擬從細(xì)胞外囊泡的定義、分離方法、移植方法及其在提高脂肪移植存活率中的作用等方面進(jìn)行綜述，總結(jié)細(xì)胞外囊泡提高脂肪移植存活率的作用機(jī)制和現(xiàn)有研究的不足之處，并展望后續(xù)研究的方向。

1 定義及特點(diǎn)

EVs 是由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外微環(huán)境的膜狀囊泡。血液、尿液、腦脊液、唾液、羊水、母乳等體液中均含有EVs。盡管EVs 目前指代所有的分泌囊泡，但其內(nèi)容物、大小以及膜組成實(shí)際上是高度異質(zhì)及動(dòng)態(tài)變化的[11]。EVs 主要分為三類：外泌體、微囊泡及凋亡小體，這三種EVs 產(chǎn)生的機(jī)制有所不同。外泌體的形成始于細(xì)胞內(nèi)陷形成多囊泡體，多囊泡體與胞膜融合后以出芽的方式分泌到細(xì)胞外。微囊泡是細(xì)胞膜以直接向外出芽的方式向內(nèi)環(huán)境中分泌囊泡。凋亡小體是在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的[11]。在功能上，EVs 具有運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)、核酸和脂質(zhì)的能力，EVs 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過以上幾種生物分子進(jìn)行傳遞，參與跨細(xì)胞的信息交流，從而影響分泌細(xì)胞以及受體細(xì)胞的各種生理、病理活動(dòng)[12]。

在電子顯微鏡下，ADSCs 分泌的EVs 大多呈杯形或球形，為脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑為50～1 000 nm，平均電位在-16.68 mV 左右,高表達(dá)CD9、CD63、CD81、TSG101，低表達(dá)3-磷酸甘油醛脫氫酶、鈣聯(lián)蛋白[8,13-16]。其中,外泌體為兩面凹陷的圓盤形或杯形，直徑大多在20～400 nm，大多數(shù)粒徑小于200 nm，表面標(biāo)志物包括CD9、CD63、CD81、TSG101、β-actin 等[17-21]。

2 分離及輔助移植方法

吸脂手術(shù)獲得的脂肪組織中含有豐富的EVs[8]。EVs 的分離是關(guān)鍵步驟，分離方法包括差速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法、超濾法和凝膠滲透色譜法等[22]。其中，最常使用的是差速離心法，即將脂肪抽吸液中的液體成分采取逐漸提高離心速度的方法進(jìn)行分離。起始的離心速度較低，將較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集上清液，改用較高的離心速度離心上清液，將較小的EVs 顆粒沉降，以達(dá)到分離EVs 的目的[8]。EVs 輔助脂肪移植的操作方法主要有兩種：一種是將脂肪顆粒注射到皮下，再將外泌體注射入靜脈中[20]；另一種是將脂肪顆粒與EVs 混合后再進(jìn)行移植[8,13,16]。

3 EVs 提高脂肪移植存活率

EVs 與脂肪混合移植后移植物體積、濕重均顯著高于單純脂肪移植組[13,16,19]。然而，有研究表明，術(shù)后2 周富含EVs的移植物體積留存率與單純脂肪移植組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在第4 周、8 周時(shí)兩組體積留存率才有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示EVs 的作用具有一定的時(shí)間依賴性[23]。除了提高脂肪移植存活率，EVs 還有助于維持脂肪結(jié)構(gòu)完整性。對(duì)添加外泌體的移植物和單純脂肪移植物切片進(jìn)行脂滴包被蛋白（活體人類脂肪細(xì)胞的標(biāo)志物）染色，添加外泌體的移植物切片中脂滴包被蛋白陽(yáng)性的脂肪細(xì)胞數(shù)量多于單純脂肪移植組[13,17]。

4 EVs 提高脂肪移植存活率的機(jī)制

4.1 促進(jìn)血管生成

4.1.1 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管狀形成

由于移植物的血運(yùn)局限于移植組織的外周區(qū)域，而中央?yún)^(qū)域缺少營(yíng)養(yǎng)和氧氣，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞與干細(xì)胞凋亡，從而使得移植后脂肪體積逐漸減小。因此，提高移植物受區(qū)血運(yùn)有助于提高脂肪移植存活率[20]。激光多普勒血流檢測(cè)儀檢測(cè)到添加外泌體的移植物周圍微循環(huán)血液灌注增加，而不含外泌體的移植物表面血管化相對(duì)較差[17]。

EVs 可促進(jìn)血管生成。血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是血管生成的基礎(chǔ)。造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)CD34[24]，使用CD34 抗體對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組化染色可發(fā)現(xiàn)添加EVs 的移植物CD34 表達(dá)明顯增加，表明移植物中毛細(xì)血管數(shù)量增加[16]。CD31 是內(nèi)皮細(xì)胞及其祖細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物[24]，對(duì)脂肪移植物切片進(jìn)行CD31 免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)添加EVs 的移植物中CD31 表達(dá)增加，表明毛細(xì)血管密度升高[14-15,17-20]。此外，EVs 輔助移植組Ki67+細(xì)胞含量增加，提示內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[13,16]。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估EVs 對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）遷移速度的影響，在培養(yǎng)基中添加EVs 后觀察到hUVECs 的遷移速度在第12、24 小時(shí)顯著增加，表明EVs 可加速HUVECs 遷移[8,17]。

ADSCs 分泌的EVs 可促進(jìn)hUVECs 管狀結(jié)構(gòu)形成，表現(xiàn)為hUVECs 與EVs 共同培養(yǎng)后，hUVECs 管狀結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度及數(shù)量顯著增加[8,13]。在培養(yǎng)基中添加外泌體12 h 后，hUVECs的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量達(dá)到峰值，表明外泌體的影響可能具有一定時(shí)間依賴性，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的促進(jìn)血管生成的蛋白與脂肪細(xì)胞接觸后發(fā)揮作用，12 h 后可能會(huì)被滅活[18]。Nie 等[23]比較了濃度為0、25、50、100 μg/mL 的富含EVs 的脫細(xì)胞脂肪組織凝膠，發(fā)現(xiàn)50 μg/mL 的EVs 促進(jìn)管狀形成的能力最強(qiáng)，繼續(xù)增大EVs 劑量并不能進(jìn)一步增強(qiáng)EVs 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的能力，提示EVs 的作用具有一定的濃度依賴性。

4.1.2 提高促血管生成因子表達(dá)

EVs 可通過促進(jìn)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的分泌而發(fā)揮作用。qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外泌體可以上調(diào)血管生成素-1 和酪氨酸蛋白激酶受體-1 的mRNA 的表達(dá)[18]。EVs通過上調(diào)let-7 家族的表達(dá)，抑制argonaute1 的mRNA 表達(dá)，最終增加了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的mRNA 表達(dá)[15]。EVs 中所含的蛋白質(zhì)、肽類也可促進(jìn)血管生成。外泌體輔助移植可提高移植物中30 多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)，包括VEGF、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管生成素、酪氨酸蛋白激酶受體-2、單核細(xì)胞趨化蛋白、過氧化物酶體增殖物活化受體γ、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-β 等[18]。VEGF 是內(nèi)皮細(xì)胞特有的血管生成因子[25]，VEGF/VEGF-R 信號(hào)在調(diào)控新生血管形成中起關(guān)鍵作用，如誘導(dǎo)基因表達(dá)、調(diào)節(jié)血管通透性、促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和存活[26]。研究發(fā)現(xiàn)，添加外泌體的移植脂肪中VEGF-R 表達(dá)均高于單純脂肪移植組，表明VEGF/VEGF-R 參與了外泌體介導(dǎo)的體內(nèi)血管生成[16,18]。

4.2 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

除了促進(jìn)移植物早期血運(yùn)重建外，EVs 還可以減輕脂肪移植物中的炎癥反應(yīng)。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，EVs 輔助脂肪移植組的脂肪形態(tài)更完整、細(xì)胞分布更均勻；而單純脂肪移植組中脂肪組織出現(xiàn)更多的壞死、纖維化及炎癥浸潤(rùn)[13]。單純脂肪移植15 d 后可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織壞死；然而在添加外泌體的移植物中直到30 d 后才出現(xiàn)這些病理變化，并且壞死的程度較輕[18]。

EVs 可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化上調(diào)M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)，繼而促進(jìn)脂肪移植物血管生成并提高脂肪移植存活率。巨噬細(xì)胞分為M1 和M2 兩種類型，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)可影響其促炎和抗炎反應(yīng)：M1 型巨噬細(xì)胞是具有病原體殺傷能力的促炎表型，M2 型巨噬細(xì)胞是具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)的抗炎表型[27]。被攝取到巨噬細(xì)胞中的EVs 可誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞的極化。將添加EVs 的移植物切片進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)移植物外周及中心區(qū)域F4/80+、CD206+的M2型巨噬細(xì)胞密度增加；流式細(xì)胞分析也提示添加EVs 的移植物CD206+M2 型巨噬細(xì)胞比例增加，CD11c+M1 型巨噬細(xì)胞比例減少[14]。在轉(zhuǎn)錄層面，ADSCs 分泌的外泌體與巨噬細(xì)胞一同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)M2 型巨噬細(xì)胞的mRNA 表達(dá)增加[20]。巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制還未完全闡明，有研究提出ADSCs 分泌的外泌體通過分泌let-7c，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-δ 表達(dá)水平，導(dǎo)致M2 巨噬細(xì)胞分化增加，M1 型巨噬細(xì)胞分化減少[20]。分別將生理鹽水和M2 型巨噬細(xì)胞與移植物混合后移植到小鼠頭皮下，移植3 個(gè)月后發(fā)現(xiàn)添加M2 型巨噬細(xì)胞的移植物與添加生理鹽水的移植物相比，血管密度增加了157%，且添加M2 型巨噬細(xì)胞的移植物體積約為添加生理鹽水移植物的2.6 倍，表明M2 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)移植物新生血管生成并提高自體脂肪移植存活率[28]。

5 總結(jié)與展望

EVs 中豐富的蛋白質(zhì)及核酸組成可調(diào)節(jié)血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移等，最終提高了移植脂肪的存活率[8]。EVs 作為一種新型納米材料已被廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域，但是在應(yīng)用EVs 的過程中尚存在許多問題。首先，EVs 的來源有限，EVs 的產(chǎn)量成為研究的限速步驟。可通過3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)擴(kuò)增細(xì)胞，或者是改良提取技術(shù)，在提取EVs 的過程中盡可能減少損失[16,21]。其次，從脂肪抽吸液中提取的EVs 是混合物，分析EVs 的具體成分有助于進(jìn)一步了解EVs 對(duì)脂肪存活率的影響[8]。再次，由于EVs 在組織中壽命很短，限制了其在實(shí)際臨床工作中的應(yīng)用，與單次使用總量相同的EVs 相比，多次定時(shí)添加EVs 可以更好地提高脂肪移植存活率[8,29]。此外，獲取外泌體的過程十分復(fù)雜，目前已有去除白細(xì)胞的純化外泌體產(chǎn)品，可避免同種異體的免疫排斥反應(yīng)；并且該產(chǎn)品可在室溫下存放一年，便于運(yùn)輸和保存[30]。目前EVs 輔助脂肪移植的體內(nèi)研究?jī)H限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，待臨床應(yīng)用推廣還有很長(zhǎng)的距離。隨著EVs 輔助脂肪移植研究的不斷進(jìn)展，EVs有望成為提高脂肪移植存活率的理想方法。