頰脂墊干細胞在骨組織工程中的研究進展

楊曉華 何樂人

近年來應用骨組織工程修復骨缺損已取得一定的臨床進展，目前骨髓間充質干細胞仍是骨組織工程最常用的干細胞來源，但存在以下缺點：獲取時需對供體進行侵入性操作，不僅創傷大[1-2]，獲得的干細胞少[3-4]，而且供體年齡會影響干細胞的成骨分化能力[5-6]。脂肪來源干細胞具有多向分化的潛能，且來源廣泛，獲取相對容易[3]，所以脂肪干細胞具有一定優勢。

但吸脂術要求具有一定厚度的皮下脂肪，且術后常常存在血腫、硬結、感覺異常等并發癥。頰脂墊是位于頰肌和咬肌之間的一團具有完整包膜的脂肪組織，位置固定，體積與年齡、性別、體重無明顯相關性，個體差異小。因易于從口腔內獲取，血供豐富，具有一定體積，已被廣泛用于口腔和頜面整形修復手術中[7-8]。

研究發現頰脂墊中存在具有成骨分化能力的干細胞。本文對頰脂墊來源干細胞的研究應用進展進行綜述，總結其成骨能力和誘導新生骨的潛在優勢，為骨組織工程種子細胞來源提供參考。

1 頰脂墊干細胞和誘導成骨分化

20 世紀80 年代發現脂肪組織中存在干細胞以來，獲取皮下脂肪干細胞的實驗方法是經過膠原酶消化、過濾、離心除去成熟脂肪細胞后，得到基質血管組分（SVF），該組分是包含脂肪間充質干細胞（Adipose stromal/stem cell，ASC）、內皮細胞、紅細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、單核/巨噬細胞、周細胞在內的異質性成分[9]。2006 年，Pyo 等[10]將該實驗方法用于頰脂墊，獲取的細胞濾液傳代培養，取第3 代細胞，免疫熒光實驗示該細胞群表面標志物CD34-、CD105+、STRO1+，繼續培養并分別接種于普通培養基和成骨誘導培養基，發現成骨誘導培養基中的細胞在第14、21 天ALP 活性顯著升高，茜素紅濃染，第21 天RT-PCR 檢測到OC 基因的表達。該實驗證實頰脂墊中也存在干細胞，并且可以分化成骨。2010 年，Farre′-Guasch 等[11]運用相同的分離方法得到頰脂墊中的間充質干細胞（BFP-ASC），陽性對照采用皮下脂肪干細胞（SC-ASC），經誘導培養后兩種脂肪細胞形態相似，都表達CD73、CD90、CD105，不表達CD45、CD19、CD14、HLADR，ALP 水平在第7天后開始上升，2 周后茜素紅染色濃染，成骨相關基因表達增加。該實驗證實在合適的誘導條件下，頰脂墊中的基質血管組分含有的干細胞能向骨組織細胞分化。

2 頰脂墊干細胞特性和成骨分化能力

Farré-Guasch 等[11]觀察到，在培養的第2～4 天BFP-ASC保持靜止狀態，之后快速生長分裂至融合狀態，呈單層大扁平細胞樣，培養7 d 后，BPF-ASC 的形態變成成纖維細胞樣的紡錘型，這是間充質干細胞的典型形態。Broccaioli 等[12]、Niada等[13]之后的研究也都觀察到，不論是取自人還是豬的頰脂墊，大概在傳代培養至第7 天，BFP-ASC 會變成紡錘型細胞。

通常對傳代培養至第2～4 代的細胞進行流式細胞學分析，大部分體外試驗[11-12，14]都發現人BFP-ASC 表達間充質干細胞表面標志物：CD105、CD73、CD29、CD90、CD44，極少量甚至不表達 造血系細胞表面標志[13]：CD45、CD19、CD14、HLADR、CD34、CD31、CD146 是血管內皮細胞譜系的代表性標志物，培養初期的BFP-ASC 能表達CD146、CD29，經過傳代培養后CD146 消失。但Rezai 等[15]在第3 代BFP-ASC 中也觀察到CD146、CD34 的高表達，考慮是因為頰脂墊是富血管的脂肪組織，且微血管的存在有利于新生骨的生長[11]。Fuji maki[16]發現第1 代BFP-ASC 中18.6%細胞表現為αSMA+（肌細胞），12.8%細胞表現為CD45+（淋巴細胞），13.3%細胞表現為CD11b+（單核細胞），進一步證實了從SVF 中分離的BFP-ASC 是一群異質性細胞。ASC 表面不表達免疫相關抗原[17]，如MHC-II、HLA-DR、CD40、CD40L、CD80、CD86，并且抑制自體細胞誘導的淋巴細胞增殖。

Farre′-Guasch 等[11]計數了每克脂肪組織的細胞產量，結果顯示每克BFP 組織細胞產量與每克SC 組織細胞產量沒有統計學差異；Broccaioli 等[12]從皮下組織和頰脂墊中也獲取了近似的細胞產量，多個實驗比較細胞倍增時間、MTT 實驗結果、成纖維細胞集落形成單位計數（Fibroblast-colony-forming unit assay，CFU-F），結果顯示SC-ASC 與BFP-ASC 結果相近，沒有統計學差異，表明BFP-ASC 具備脂肪干細胞的生長分裂能力[12-13]。

Farré-Guasch 等[11]觀察到培養1 周后，人BFP-ASC 在逐漸形成成纖維細胞的過程中，ALP 的活性逐漸升高直至第21天，第7 天的ALP 活性是初始細胞的2.5 倍，第14 天是16.5 倍。在誘導骨分化的第14 天，成骨基因CBFA1、骨連接素基因SPARC 的表達分別增長了8 倍、2 倍，免疫熒光顯示BFP-ASC 在骨誘導培養后表達骨鈣素（Osteocalcin，OCN），BFP-ASC 在骨誘導培養2 周后顯微鏡下見茜素紅強染色，提示細胞外基質的鈣沉積顯著。對豬BFP-ASC 和SC-ASC 的研究表明，兩組ASC 都在骨誘導分化后高表達膠原蛋白、鈣化沉積的細胞外基質、骨連接素和高活性ALP[18]。

3 頰脂墊去分化脂肪干細胞（DFAT）與頰脂墊脂肪間充質干細胞

頰脂墊主要由成熟脂肪組織和基質血管組分（SVF）構成，在證實了SVF 中存在干細胞后，分離出成熟脂肪細胞，通過天花板培養法從中獲取去分化脂肪細胞（Dedifferentiated fat cell，DFAT），顯微鏡下觀察細胞形態，成熟脂肪細胞通過脫去脂滴形成紡錘型的DFAT，在合適的骨誘導培養基中傳代培養能分化出骨組織。Kishimoto 等[19]從同一人體的頰脂墊中分化出ASC 和DFAT，并將兩者進行比較研究。在培養的第3 天，BFP-ASC 的DNA 含量明顯高于DFAT，但在第7、14天時兩者沒有顯著差異，兩者增殖能力相似，都表達CD90、CD105，不表達CD11b、CD34、CD45，但經過成骨誘導的DFAT 中DNA 含量、BAP、OCN、鈣分布都顯著高于ASC。成骨誘導第14 天，DFAT 的礦化結節和茜素紅染色較ASC 明顯，顯示DFAT 的骨分化能力高于ASC。

對DFAT 的研究還包括成脂傾向和細胞直徑。Kou 等[20]從人BFP 中分離出DFAT 后分別進行骨誘導和脂肪誘導分化，DFAT 細胞表面表達CD13、CD29、CD105、CD44，不表達CD31、CD34、CD309、CD106 和α-SMA，盡管將骨誘導分化的時間延長至3 周，DFAT 細胞外基質茜素紅染色仍有限，且相當大比例的細胞呈多邊形、油紅O 濃染，提示DFAT 細胞的脂肪分化能力可能強于骨分化能力，這也許和DFAT 本身來源于脂肪組織有關。Tsurumachi 等[18]以成熟脂肪細胞直徑40 μm 為界，研究大、小脂肪細胞去分化為DFAT 細胞的差異，結果大DFAT、小DFAT 都高表達CD13、CD90、CD73、CD105、CD44，增殖能力沒有差異，但S-DFAT 多向分化相關基因表達水平更高，ALP 活性、茜素紅染色、鈣分布更多。該研究還發現，小DFAT 在1 周的傳代培養后逐漸在細胞表面表達CD146，且表達水平大于大DFAT，之前的研究中DFAT表面不表達CD146，認為這是因為DFAT 在傳代培養的過程中逐漸獲得周細胞的特征。

4 頰脂墊間充質干細胞與皮下脂肪干細胞的對比

體外試驗表明，頰脂墊間充質干細胞的增殖能力、成骨分化能力與皮下脂肪干細胞相當。張圣敏等[21]分別提取面部輪廓整形手術中獲取的人頰脂墊和吸脂術獲取的皮下脂肪，分別進行體外傳代培養與成骨誘導，發現兩種干細胞形態差異不大，均表達CD44，不表達CD34，但頰脂墊細胞產量高于皮下脂肪，ALP 水平也顯著高于皮下脂肪，表明頰脂墊含有的脂肪干細胞生物學活性優于吸脂術皮下脂肪。Broccaioli等[12]的研究表明，上述兩種脂肪干細胞都表達CD73、CD90、CD105，不表達CD34、CD31、CD14，細胞形態、增殖速度、細胞產量無顯著差異，ALP 活性和膠原分布都顯著上調。該研究顯示，SC-ASC 表現為高度特異性的成纖維細胞樣形態，細胞之間形態同質性高，BFP-ASC 相較之下同質性低，且細胞更小更圓。Niada 等[13]從豬身上獲取頰脂墊和皮下脂肪，兩種干細胞的細胞產量、形態、倍增時間、細胞活性相似，傳代培養至第1～4 代都表現出良好的集落形成能力，都表達CD90，不表達CD271、CD14、CD45、CD73、CD105，膠原、鈣化細胞外基質、ALP 活性、黏骨素表達都增加。考慮到頰脂墊組織采集量較少，認為頰脂墊脂肪干細胞的成骨能力優于一般皮下脂肪。Rezai 等[15]對比頰脂墊干細胞（BFPdSCs）、腹部脂肪干細胞（AbdSCs）、臀部脂肪干細胞（HdSCs）的干細胞特性，結果三種干細胞都高表達CD90、CD73、CD105、CD44，不表達CD34、CD45，BFPdSCs 中小部分細胞表達CD34、CD146，在低代細胞系，BFPdSCs 增殖速度更快、倍增時間更短。基于之前的研究，細胞傳代培養代數會影響多向分化的能力，基因突變、細胞癌變、細胞凋亡和細菌污染的風險升高，因此認為干細胞療法最好取用低代次的干細胞，安全性更好。成骨能力方面，在該實驗中，在第7、14 天，BFP-ASC 的ALP、BMP2（早期成骨相關標志物）表達水平更高，第14 天時BFP-ASC 的RUNX2 表達水平明顯更高。

5 頰脂墊間充質干細胞與其他干細胞的對比

Ghaderi 等[22]發現頰脂墊干細胞（BFP-MSCs）、牙槽干細胞（GDCs）都表達CD166、CD90、CD73、CD105、CD44，不表達CD34、CD45、CD14，但BFP-MSCs 鈣化結節分布更多，成骨相關基因BGLA、BMP2 轉錄水平更高。相較于牙槽干細胞，頰脂墊干細胞是更優良的組織工程種子細胞。Genova 等[23]對比頰脂墊干細胞（BFPSCs）、牙髓干細胞（DPSCs），兩種干細胞都能分化出骨樣細胞、分泌鈣化基質，但BFPSCs 細胞產量、增殖水平更高，雖然骨鈣素釋放也更高，但沒有統計學差異。

6 誘導頰脂墊干細胞成骨分化的因素研究

骨形態發生蛋白（BMP）是能誘發異位性骨生成的轉化生長因子之一，是常見的骨誘導培養基添加劑。Kim 等[24]研究BMP 濃度（0、10、50、100、200 ng/mL）對成骨分化的影響，結果顯示50 ng/mL 以上的培養基中能在第14 天觀察到ALP 染色、茜素紅染色，第21 天染色加深，其中100 ng/mL 染色最深，第21 天各組均表達骨鈣素，骨鈣素的表達與BMP2 濃度相關，BMP2 超過100 ng/mL 骨鈣素表達下降。研究指出，誘導頰脂墊干細胞成骨分化的BMP2 濃度至少應大于50 ng/mL。Shiraishi 等[14]將添加了BMP 的培養基與骨誘導培養基（Osteoinductive reagents，OSR）對比，BMP 組ALP 水平顯著高于其他組，BMP 組、BMP+OS 組茜素紅染色顯著，成骨基因runx2、ocn、opn 表達顯著上調，BMP 能誘導頰脂墊干細胞成骨分化。

Nagasaki 等[25]發現，低強度脈沖超聲（LIPUS）聯合納米羥基磷灰石（NHA）處理的頰脂墊干細胞ALP 活性更高，茜素紅濃染，成骨相關基因表達更多，證明LIPUS 處理和NHA 支架能協同促進頰脂墊干細胞成骨分化。

Shekarchi 等[26]研究雷奈酸鍶對頰脂墊干細胞的成牙質骨誘導作用，濃度梯度為0、6、12.5、25、50、100 和200 μmol/L，結果100 μmol/L 組鈣化水平最高，50、100 μmol/L 組頰脂墊干細胞成牙骨質蛋白表達水平最高，100 μmol/L 組ALP 水平最高，200 μmol/L 組OCN 水平最高。研究認為雷奈酸鍶可上調BFPSCs 成牙骨質基因，誘導成牙骨質分化，并有劑量依賴性，可用于改善正畸治療后的牙根吸收。

7 支架作用

Broccaioli 等[12]的研究顯示，BFP-ASC 與釉原蛋白（Amelogenin，AM）混合培養1 周后接種在膠原蛋白膜和聚羥基乙酸上，都表現出高ALP 活性和廣泛的膠原蛋白分布，這兩種生物材料都具有良好的生物相容性，掃描電子顯微鏡觀察也表明BFP-ASC 能較好地黏附于膠原蛋白膜和聚羥基乙酸上。Ardeshirylajimi 等[27]構造了被覆Bio-oss 骨粉的聚乳酸納米支架，接種BFP-ASC 后，細胞黏附良好，與對照組相比，高表達干細胞標志物（CD40、CD90、CD105），ALP 活性高，茜素紅濃染，鈣沉積增多，證實了該支架良好地模擬了骨組織的細胞外環境，起到良好的支撐細胞和促進生長的作用。Shiraishi 等[14]在體外證實了重組人骨形態發生蛋白-2（rhBMP-2）對BFP-ASC 的骨形成誘導作用后。Bastami 等[28]通過構建混合殼聚糖納米顆粒的磷酸三鈣（TCP）/明膠支架，證實了該支架具有緩慢釋放BMP2 的作用，并加強了對BFP-ASC 的骨誘導作用。Golchin 等[29]將姜黃素混入殼聚糖/聚羥基乙酸納米支架中，體外試驗證實支架具有良好的生物支撐性能，接種于上的BFP-ASC 成骨分化良好。羥基磷灰石能促進BFP-ASC 成骨[25]，有研究將生物陶瓷納米羥基磷灰石涂抹于聚己內酯（PCL）支架上，構建PCL-Bio 支架[30]，種植的BMSC、BFP-ASC 都能良好生長和進行成骨分化。但Rezai 等[31]的實驗中，在被覆膠原蛋白的羥基磷灰石/β-TCP3D 打印支架上比較誘導多能干細胞和BFP-ASC 的成骨潛能，發現該支架對ASC 沒有誘導成骨作用。研究顯示，明膠-羥基磷灰石/氧化石墨烯支架能持續釋放維生素D[32]，有利于BFP-ASC 的生長和分化。目前，大部分的支架實驗都證實了對頰脂墊間充質干細胞的誘導成骨和支持作用，聯合應用支架和干細胞誘導體內成骨是修復骨缺損的趨勢，但還需要更多的體內試驗數據支持。

8 臨床試驗

已有研究將頰脂墊脂肪間充質干細胞應用于臨床試驗，從目前的報道來看，BFP-ASC 能在人頜面骨中良好地誘導產生新生骨組織。Khojasteh 等[33]在8 個巨大頜骨萎縮的患者中進行控制對照試驗，觀察BFP-ASC 對牙槽嵴的修復效果。對照組將前髂嵴骨移植入牙槽骨缺損部位，填充凍干骨顆粒生物支架并覆蓋膠原蛋白膜，實驗組的凍干骨顆粒在填充前種植BFP-ASC，術后5 個月時進行臨床效果評估。活檢顯示，新生骨融入并生成了類骨基質，新生骨比例在對照組中為49.21%，試驗組為65.32%。自體髂骨移植同時滿足了骨髓干細胞和機械支撐的移植條件，但術后骨質吸收率高，1 年后的骨質吸收率在35%～51%。Khojasteh 等[33]認為添加BFP-ASC能輔助骨組織再生，聯合自體髂骨移植能減少術區骨質吸收。Khojasteh 等[34]進行前瞻性隨機臨床試驗，發現髂前嵴聯合BFP-ASC 能促進牙槽突裂骨缺損區新生骨重建，側支皮質骨板對支架上的干細胞有機械保護作用。Khojasteh 等[35]從14 例下頜骨萎縮患者中采集BFP-ASC，分別將BFP-ASC 和自體骨顆粒與牛骨礦物支架以1∶1 的比例混合，術區覆蓋鈦網支撐固定，術后6 個月利用錐形線束計算機體層成像（Cone beam computed tomography，CBCT）評估下頜骨體積增量，結果顯示兩組水平方向和垂直方向的骨體積增加沒有顯著差異，頰脂墊也許能取代自體骨顆粒作為移植供點，減少手術創傷和術后并發癥。Meshram 等[36]從5 例頜骨缺損患者中采集頰脂墊組織，體外擴增培養得到的BFP-ASC 直接逐滴加入骨缺損區，影像學評估顯示術后1 個月所有患者術區出現不規則的骨小梁，接下來的3～6 個月逐漸被致密骨取代，證實BFP-ASC 對頜骨2 cm×4 cm 左右缺損的臨床修復能力。Meshram 認為，考慮到BFP-ASC 的成骨能力和效率，避免聯合生物支架應用于骨組織工程，能減少宿主對合成高分子材料的免疫排斥反應。Khojasteh 等[33]將BFP-ASC 接種于天然牛骨礦物材料上，移植人體后6 個月后修復了2 例巨大牙槽骨缺損，隨后進行牙種植術，術后10 個月種植體生長良好。Akhlaghi 等[37]則將BFP-ASC 接種于人羊膜上，修復了5 例下頜骨缺損。

9 結論

大量的研究證明，頰脂墊含有多向分化潛能的間充質干細胞，獲取方便、創傷小，干細胞產量大，成骨誘導分化能力明確，頰脂墊干細胞表達血管形成標志物，微血管的存在更有利于新生骨長入，是良好的干細胞組織供材。頰脂墊干細胞與皮下脂肪干細胞相比，兩者的成骨分化能力相當，對于皮下脂肪菲薄、不宜進行吸脂術的患者是另一種可供參考的選擇。但要將頰脂墊干細胞應用于臨床仍需進一步評估頰脂墊的實用性。目前頰脂墊干細胞的臨床研究集中于骨組織工程，基礎實驗也研究了頰脂墊干細胞的軟骨分化能力，為組織工程軟骨移植提供了新思路。