組織工程和3D 生物打印下耳廓構建的研究進展

何蓓 章慶國

【提要】 小耳畸形是我國第二多見的先天性顱面部疾病，主要表現為耳廓發(fā)育不全，部分患者同時合并外耳道狹窄或閉鎖、中耳畸形。多年來，耳廓再造因其復雜性和精細性一直是整形外科面臨的巨大挑戰(zhàn)。自體肋軟骨移植和Medpor 支架植入是目前臨床最常用的兩種手術方式，但依舊存在各自的局限性。近年來，以組織工程和3D 打印技術為核心的耳廓構建模式取得了一定的研究成果，給未來小耳畸形的治療提供了新的可能。

先天性小耳畸形是胚胎在耳廓發(fā)育期間受到遺傳或外界因素影響最終出現外耳表現異常的疾病，常伴有外耳道狹窄或閉鎖、中耳畸形和（或）頜面畸形，除了影響外觀和功能外，也給患兒心理健康造成負面影響。手術是治療小耳畸形的最佳手段，目前耳廓再造的手術方法主要是自體肋軟骨移植和Medpor 支架植入，但現有材料和方法可能造成各種并發(fā)癥。隨著組織工程和3D 打印技術在再生醫(yī)學領域的廣泛研究和運用，有望構建出符合天然耳廓組織學、功能和形態(tài)的新型耳廓支架，為小耳畸形的治療提供新的選擇，以克服目前常用支架的不足。本文就耳廓再造中利用的主要材料，以及近年來以組織工程、3D 打印技術為基礎進行的耳廓構建研究進行綜述。

1 自體肋軟骨和Medpor 支架

自體肋軟骨具有來源豐富、組織相容性良好、耐壓性強、無排斥反應等眾多優(yōu)點，是目前國內外耳廓再造手術的首選支架材料，主要通過手工雕刻成形后進行一期或多期植入。但該方法存在諸多不足，最顯著的為供區(qū)相關并發(fā)癥，最常見是供區(qū)疼痛，及其導致的呼吸變慢變淺，從而引起術后肺不張、肺部感染等[1]；另外還有供區(qū)瘢痕、氣胸、胸廓畸形等[2-3]。目前，患兒的手術年齡受自體肋軟骨發(fā)育情況限制[4]，且術中支架雕刻難度大，手術效果很大程度依賴于醫(yī)生的經驗與技術[5]。

1983 年，Berghaus 等[6]首次報道將多孔高密度聚乙烯運用在耳再造手術中。1984 年，Medopr 被正式批準可植入人體。Medpor 支架開放且互相交通的孔隙結構有利于修復部位的組織和血管向內生長，具有良好的組織相容性和結構穩(wěn)定性[7]。該材料經過加熱后具有優(yōu)良的塑形性，已被廣泛用于鼻整形、眼眶整形、口腔頜面重建和顱骨重塑[8-9]。Medpor 耳支架分為“C”形耳輪和“Y”形耳基兩部分，組裝好的支架可以通過顳淺筋膜瓣伴皮片移植Ⅰ期完成耳再造，或通過耳后皮膚擴張并或不并筋膜瓣覆蓋Ⅱ期完成再造手術[10]。該支架的使用使手術不受自體肋軟骨發(fā)育限制，手術平均年齡也可被適當提前[11]。該支架內部快速血管化保證了較強的抗感染能力，本身的惰性也增強了抗菌性。近年來，將該材料運用在擴張器期間耳后皮膚出現破潰感染[12]、燒傷性瘢痕耳[13]、部分耳廓缺損的修復[14]中也取得了不錯的效果。雖然多年臨床實踐證明其排斥反應和遠期吸收率都很低，但是該材料物理性質過硬、應力性能較差，支架外露導致感染的風險較大，往往需重新植皮修復。目前建議只有當肋軟骨鈣化嚴重或極不愿意使用自體肋軟骨的情況下考慮使用Medpor 支架[15]。

2 組織工程耳廓構建

利用組織工程重建耳廓的理想情況是將具有成軟骨能力的種子細胞和支架材料結合，構建出具有特定形態(tài)、組織及功能的人耳狀軟骨，植入體內修復缺陷[16]。耳組織工程的核心在于支架材料和種子細胞的選擇。目前常用的支架材料根據來源可分為天然生物材料和人工合成材料，前者如膠原、透明質酸、藻酸鹽、殼聚糖等，后者如聚羥基乙酸（Poly-glycolic acid，PGA）、聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）、聚己內酯（Poly-caprolactone，PCL）、聚氨酯（Polyurethane，PUR）等[17-19]。種子細胞需要具備取材方便、增殖分化能力強、與支架材料組織相容性良好以及生物安全等特點，軟骨細胞和干細胞是耳組織工程研究中的主要細胞來源[20]。

2.1 軟骨細胞-支架構建體

Zhao、Pomerantseva 等[21-22]分別嘗試將綿羊耳軟骨細胞接種在Ⅰ型膠原支架，前者觀察到了豐富的Ⅱ型膠原、彈力纖維等軟骨細胞外基質成分生成，并提出在植入體內之前有一個較長的體外動態(tài)培養(yǎng)時間更有利于預測支架的最終尺寸；而后者構成的耳形支架也獲得了綿羊自體內培養(yǎng)的成功。種植了兔耳軟骨細胞的PLA 支架、多孔PUR 人耳形支架[23-24]都在低免疫活性動物體內實現了成熟軟骨組織的再生，并保持了完整的耳廓形狀、良好的機械性能和熱學穩(wěn)定性。在對聚氨酯耳支架的進一步探索中發(fā)現，規(guī)則的孔徑分布、合適的孔徑大小和高孔隙率是提高細胞增殖率，膠原和血管組織填充的關鍵因素[25]。NaKao 等[26]將人殘耳軟骨細胞接種在納米纖維PGA 支架上，得到了與正常耳軟骨細胞來源幾乎無異的軟骨組織。劉戈等[27]驗證了人殘耳軟骨細胞聯合非降解PUR 支架用于修復耳廓組織缺損的可行性，同時發(fā)現體內環(huán)境比體外更利于軟骨組織生成。

天然材料雖具有良好的生物相容性、可吸收性，但機械強度差、降解速度不穩(wěn)定[28]。人工合成材料可以通過化學和物理變性而改變其生物和材料特性，具有較強的可塑性和機械性[29]，但其生物相容性大多不如天然生物材料，且降解產生的酸性物質會改變細胞生長發(fā)育的微環(huán)境。Cao 等[30]使用牛關節(jié)軟骨細胞和PGA/PLA 材料構成的3D 耳廓，在無胸腺小鼠體內成功構建了人耳形態(tài)組織工程軟骨，為組織工程耳廓的構建提供了新思路，各類復合材料也成為主要的支架研究對象，旨在克服單一材料的缺陷[31]。García-López[32]在殼聚糖-聚乙烯醇-表氯醇水凝膠支架上接種豬耳軟骨細胞后也觀察到了耳軟骨類似組織形成。2018 年，Zhou 等[33]報道將患者自體殘耳軟骨細胞接種在3D 打印的PCL/PGA/PLA 耳形支架上，在人體內實現了組織工程耳廓軟骨組織的再生，象征著組織工程耳廓由動物實驗向臨床轉化的重大進展。Lee 等[34]將兔耳軟骨細胞分別接種在PLGA 支架、PLGA-Medpor 支架，結果發(fā)現后者可以產生更多成熟的軟骨組織，并具有更強的抗壓、抗皮膚張力能力。Medpor 的存在提供了良好的軟骨微環(huán)境并提高了支架的機械性能，而可生物降解的PLGA 和工程組織軟骨的包裹，又克服了Medpor 材質過硬導致的暴露、感染問題。

軟骨脫細胞基質是一種理想的軟骨特異性仿生和低炎癥反應天然生物材料。Jia 等[35]制備了牛肩胛軟骨脫細胞基質與明膠交聯劑1∶1、總成分濃度為2%的混合懸液，引入PCL內芯，結合3D 打印、鑄造成型和冷凍干燥技術，成功設計出了具有合適機械強度的三維立體耳廓，結合山羊耳軟骨細胞后可在裸鼠體內再生成軟骨樣組織，并且保持良好彈性和精確人耳形結構。Bhattacharya 等[36]通過戊二醛交聯結合γ 輻射的新型脫細胞方法獲得了一種理想的無抗原活性的山羊脫細胞軟骨基質，并首次用于小耳畸形患者的耳廓重建，為脫細胞基質在人耳狀軟骨再生中的應用和臨床轉化提供了重要的支持。

但是，軟骨細胞在體外培養(yǎng)過程中隨著傳代數的遞增，往往會出現快速去分化，這可能與參與維持軟骨細胞表型的DNA 甲基化和miRNA 異常表達有關[37]。即便在目前已成功的臨床病例中，使用的都是體外傳代擴增至2～3 代的自體殘耳軟骨細胞，而構建正常耳廓軟骨細胞數量需求巨大，雖然采用添加生長因子[38-40]、多層立體培養(yǎng)[41]、旋轉動態(tài)培養(yǎng)[42]等方式，均被證實可有效地誘導軟骨細胞增殖、保持擴增后細胞表型穩(wěn)定，以及促進軟骨組織形成，但是相應地增加了技術難度和操作的繁瑣程度。

2.2 干細胞-支架構建體

干細胞具有廣泛的分化潛能和更強的群體倍增能力。目前，軟骨組織工程常用的種子細胞有骨髓間充質干細胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）和脂肪間充質干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）。BMSCs 被認為比ADSCs 具有更高的軟骨形成潛能，在含有相同或不含有生長因子的培養(yǎng)條件下，前者能產生更多的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖[43]。但是，ADSCs 來源廣泛，獲取方便[44]。Tang 等[45]通過對比實驗發(fā)現，BMSCs 聯合脫細胞外基質支架無論是否添加外源性生長因子都可以生成含量豐富的軟骨基質，形成軟骨組織，克服了傳統(tǒng)添加外源性生長因子、基因轉染技術在誘導干細胞向成軟骨細胞分化過程中可能出現的軟骨骨化，甚至導致病原體污染等問題[46]。含有ADSCs 與離體小腸黏膜下層共培養(yǎng)物的耳狀支架在裸鼠體內長期保持了其復雜結構及良好的生物力學性能，這為提高組織工程耳廓的形態(tài)和力學穩(wěn)定提供了新的思路[47-48]。另外，Mahboudi 等[49]在聚左乳酸-聚乙烯醇納米纖維支架上成功誘導人誘導多能干細胞向軟骨細胞分化，提供了一種可能用于耳廓組織工程的新型組合。Kim 等[25]構建了負載扁桃體來源的間充質干細胞的3D 打印多孔聚氨酯支架和Medpor 支架，發(fā)現在體外隨著培養(yǎng)時間延長，多孔聚氨酯材料比Medopr 具有更強的細胞增殖率，而在動物體內前者生成了更明顯的膠原纖維和血管，支架的力學性能也與耳廓軟骨相似，有望成為一種新的支架替代選擇。

2.3 干細胞-軟骨細胞-支架構建體

干細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)也是目前熱門的研究方向，軟骨細胞分泌系列生長因子可以模擬天然軟骨微環(huán)境，誘導干細胞定向分化[50]，其分泌的甲狀旁腺激素（PTH）也具有抑制干細胞成骨分化的能力[51]，干細胞的存在又減輕了軟骨細胞數量需求的負擔。1∶1 混合培養(yǎng)豬軟骨細胞與豬ADSCs 高彈性冷凍凝膠（明膠/軟骨素-6-硫酸鹽/透明質酸/殼聚糖）三維支架[52]和1∶1 混合培養(yǎng)人耳軟骨細胞與人BMSCs 的膠原水凝膠人耳狀支架[29]，兩者均觀察到了與天然軟骨相似的健康軟骨組織形成。Sterodimas 等[53]首次在具有免疫活性的動物體內植入絲素蛋白/海藻酸鹽—軟骨間充質干細胞/兔耳軟骨細胞3D 耳形支架，成功再生細胞外基質和軟骨組織，且支架保持了基本的形態(tài)和柔韌性，證明這種共培養(yǎng)模式和支架組合在真實生物體內的可行性。

3 3D 生物打印技術

有別于傳統(tǒng)的3D 打印，生物打印的材料同時含有液態(tài)生物材料、種子細胞以及必要的活性因子，又稱之為生物墨水。其優(yōu)勢在于可以通過對生物墨水的精確分層放置，直接生成細胞和生物材料一體化的結構，達到既能控制功能成分空間位置，又具有特定形態(tài)的目的[54]，為具有復雜結構及組織的再生提供了新的方法。

3D 生物打印分為成像與設計、生物墨水的選擇和打印三個步驟。目前常用的打印方式有噴墨、擠壓和光輔助打印[55-56]。噴墨打印方法簡單、靈活且成本低廉，可以打印單個細胞，所以分辨率高。缺點是只能打印液體材料，且由于生物墨水的沉積容易導致噴頭堵塞，因此打印時細胞密度低，不利于組織構建。擠壓法可以打印各種黏度的水凝膠材料和高密度細胞，且能維持比較精確和完整的形狀結構。缺點是細胞分辨率低，而且打印過程中會對細胞造成較大的壓力而導致部分細胞失活。光輔助打印又分為基于數字光處理打印（DLP）和激光輔助打印。DLP 打印的焦距為納米級，所以分辨率高，而且是通過對平面投影進行打印，能保持較高的機械完整性，所以適用于打印光滑、結構復雜的模型。激光輔助打印的細胞分辨率和存活率都很高，但是打印成本較貴，而且打印的生物原材料僅限于光敏聚合物。

目前已知的可打印的生物墨水種類較少。Héctor 等[57]以人鼻軟骨細胞-納米纖維素-海藻酸鈉為復合生物墨水，采用微閥頭聯合噴墨打印技術構建形成了三維立體耳廓，觀察到軟骨特異性細胞外基質成分的生成。Lee 等[58]以聚乙二醇為犧牲層，將負載軟骨細胞的海藻酸鈉水凝膠和PCL 采用噴頭打印技術實現三維耳軟骨組織的再生，通過添加可生物降解的PCL 材料改善了單純水凝膠支架機械強度不穩(wěn)定的缺點。Bhamare 等[59]通過擠壓法對山羊耳廓軟骨細胞與聚乙烯醇/明膠組成的生物墨水進行逐層打印堆積，實現了人耳形耳廓的快速自動打印，也成功再生細胞外基質、血管及軟骨組織。Kang 等[60]描述了一種ITOP 集成打印裝置，以Pluronic F-127水凝膠為犧牲層，將載有兔耳軟骨細胞的復合水凝膠（明膠、纖維蛋白原、透明質酸和甘油）和PCL 按照特定模式打印成具有穩(wěn)定機械強度的人耳狀軟骨結構，在裸鼠體內收獲了與天然兔耳相似的軟骨組織。這種集成模式的優(yōu)勢在于可以在精確的位置融合多種細胞類型，生成各種自由的三維結構，有望在臨床中再生缺損的組織和器官，再現其自然結構和功能。

4 總結與展望

目前在動物體內外構建了許多穩(wěn)定的、可供耳軟骨細胞良好生長和分化的三維立體耳廓模式，但仍然存在許多難題需要攻克。首先，3D 生物打印對生物墨水的種類、組成成分要求較高，已知可供打印的生物墨水種類很少；其次，如何協(xié)調組織工程支架在體內降解與軟骨組織再生速率之間的平衡，保證耳廓形態(tài)得到長久維持；再者，目前大量的研究局限于體外實驗和無免疫原性的動物實驗，正常生物體內的長期安全性和有效性尚未得到有效驗證。另外，現在的研究集中于可植入的耳廓軟骨組織，尚未涉及更復雜的組織，比如脂肪、覆蓋的軟骨膜和皮膚等。未來的研究或許可以利用3D 生物打印技術通過將軟骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞與液態(tài)生物材料混合，進行成分的區(qū)域分配，提高再造耳的組織復雜性，減少需要提前擴張皮瓣或者同期、延期行皮瓣筋膜移植覆蓋的步驟，收獲真正具有完整組織的組織工程耳，為耳畸形患者的耳廓重建開創(chuàng)新的方向。