巨噬細胞介導的炎癥反應在材料生物相容性評價中的意義

李士杰 姜愛莉 劉宇 王召旭 韓倩倩

【提要】 隨著材料科學與免疫學的快速發展，越來越多的生物材料被應用于再生醫學領域。材料植入組織后引起的炎癥反應與異物反應，是組織修復與再生的障礙，也是開展產品生物相容性評價的重要內容。炎癥反應的強度及持續時間直接影響生物材料的組織相容性和有效性，巨噬細胞是主導炎癥反應與纖維化的關鍵免疫細胞，巨噬細胞的數量與行為能夠反映出材料是否具有較好的生物相容性。現階段許多研究以調節、誘導巨噬細胞為目標進行生物材料的改造。因此，生物材料相容性評價也應當重點關注巨噬細胞，以優化、改進現有的生物學評價方法，提高生物相容性評價水平。本文主要綜述了生物材料相容性評價的進展和生物材料與巨噬細胞的相互作用，重點闡明巨噬細胞在組織修復與異物反應中的“雙刃劍”作用，旨在為生物材料評價的相關研究提供優化評價方法、創新評價思路以及相關的理論依據，以推進醫療器械行業的發展。

生物材料已越來越廣泛地應用于組織修復、器官矯正等醫學領域，良好的生物相容性是醫療器械臨床安全有效應用的先決條件;但材料的生物相容性好與不好并不是一個絕對的結果，免疫反應程度對植入材料也有一定影響，需要依據材料自身性能與實際臨床應用進行綜合判斷，而對材料生物相容性的判定一直是一個復雜的問題[1]。2015 年，國家質量監督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會共同發布了GB/T16886《醫療器械生物學評價》標準，包括遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗，與血液相互作用實驗選擇，植入后局部反應試驗，刺激與遲發型超敏反應試驗，體外細胞毒性試驗，材料物理化學、形態學和表面特性表征等共20 部分。基于評價標準與現階段材料生物相容性評價經驗，體內植入試驗仍然是最重要的標準方法。將相同的生物材料植入體內不同組織或器官會引發不同強度的炎癥反應[2]。因此，我們不僅要從組織、細胞等宏觀角度去看待生物材料對系統和細胞的影響變化，更要深入到分子水平，從細胞因子、mRNA 以及基因調控的角度，多方位評價材料的相容性，建立適合我國現狀的生物學評價方法，提高生物相容性評價水平，推進醫療器械行業的發展。

理論上來說，生物材料的相容性評價應當貫穿整個材料研發、生產過程，原材料選擇、改造方法和加工助劑需要嚴格的質量控制，但通常生物材料研發與制造企業沒有完善的評價體系與設施，所以目前我國以生物材料終產品評價為主。生物相容性評價需要了解產品的原材料與添加的化學成分、是否可降解、是否含有雜質等基本信息，在此基礎上的評價結果才更加真實可靠[3]。

炎癥反應是生物材料植入后最可能引發的體內生物學反應，材料的構象、大小、數量、表面分子與化學特性都會改變或者調節炎癥反應強度。生物相容性差的材料引起過度炎癥反應，長期的炎癥會導致組織受損，在材料周圍形成較厚的纖維包囊，使材料與組織分離，無法發揮功能，最終導致植入失敗[4]。早期的研究中追求不引起炎癥反應的理想惰性材料，但后續研究指出巨噬細胞介導的炎癥反應是生物材料在組織中適當整合并發揮功能所必需的[1，5]，巨噬細胞介導的炎癥反應能夠保持組織穩態、促進創傷修復，還與異物反應有關。近20 年來，巨噬細胞對組織修復與再生的重要功能得到了醫學和生命科學領域的廣泛認可[4]，對生物材料的修飾改造從規避免疫反應逐漸轉變為適應可調節的免疫反應。越來越多的免疫調節生物材料通過調控巨噬細胞的表型極化，來促進組織重塑、提高材料的生物相容性[1]。例如：從對材料形態的改造來看，Veiseh 等[6]指出球狀材料與其他形狀材料相比，可以顯著減少巨噬細胞的黏附并且降低纖維化程度；從表面特性來看，Getts 等[7]發現表面帶負電荷的材料能夠增強巨噬細胞的吞噬能力，并促進單核細胞與巨噬細胞的凋亡，減少材料周圍巨噬細胞的聚集數量，也相對減少了異物巨細胞（FBGC）的數量。因此，認識巨噬細胞與生物材料之間的相互作用是研究積極有效生物材料的理論基礎，也是豐富生物相容性評價科學依據的重要內容。

1 材料植入后引起的異物反應

生物材料引起不可避免的異物反應與組織損傷早已被廣泛報道，異物反應是臨床上無菌性炎癥、外周組織粘連以及纖維化的主要原因[1]，嚴重阻礙了材料與組織整合的速度和質量。因異物反應導致的植入材料失效、組織壞死或其他疾病給全球造成了極大的經濟損失，是生物材料領域研發與評價亟待解決的生物相容性難題。異物反應主要由非特異性免疫系統驅動，單核細胞與巨噬細胞為主要參與群體[8]，循環單核細胞浸潤后與材料相互作用，在細胞因子等生化信號的誘導下極化為巨噬細胞。生物材料植入巨噬細胞敲除的小鼠中完全不會引起異物反應[9]。同樣，使用藥物誘導巨噬細胞缺失也可有效抑制生物材料周圍單核細胞浸潤、異物巨細胞形成和纖維化[10]。巨噬細胞憑借其廣泛的功能與表型，在異物反應中發揮關鍵作用。調節、穩定兩種極化狀態巨噬細胞之間的平衡，被認為是調節異物反應的突破點[11]。

對生物材料自身而言，膠原蛋白、透明質酸、殼聚糖、藻酸鹽等與天然組織結構相似的材料，能夠降低異物反應并在生物體內降解[12]，植入物的表面粗糙度也會影響異物反應[13]。研究，材料的表面化學可影響吸附在材料表面蛋白質的數量、種類與構象，并會影響細胞黏附、擴散和增殖[14]。因此，選擇與天然組織結構相似的生物材料并對其改性，能夠最大限度降低異物反應。Man 等[15]運用殼聚糖水凝膠-脫礦質骨基質混合支架移植同種異體軟骨細胞來修復兔軟骨損傷，使用殼聚糖水凝膠填充脫礦質骨基質的大孔，改善支架中種子細胞的分布，同種異體軟骨細胞移植24 周后未觀察到明顯的炎癥反應。生物材料植入后造成組織水腫與出血，血液中的各種蛋白被吸附到材料表面。Rostam 等[16]發現，較厚的蛋白質層可能與M1 型巨噬細胞有關，通過降低蛋白質的黏附能夠減少巨噬細胞附著，并促進M2 型巨噬細胞極化。現代臨床醫學中的許多程序依賴于使用電子植入物來治療創傷性損傷的病癥。Kang 等[17]研發了一種生物可吸收的硅電子傳感器，硅是一種生物可降解無機材料，所有的植入材料都可以通過水解或代謝作用被自然吸收，并且可以調節元件與封裝材料的厚度來控制其在生物體內的持續時間，傳感器及其在顱內空間溶解的副產物是生物相容的，通過應用終產物生物相容性好的材料與精確的設備生命周期調控，能夠極大地降低異物反應。這種可降解吸收類生物材料為有效避免異物反應提供了非常具有吸引力的材料改造思路，但其與免疫細胞的相互作用需要更加深入的研究，對生物材料相容性的評價需要精確、適合的評價方法。

2 巨噬細胞在炎癥反應中的作用

生物材料植入組織后誘發炎癥反應，最先到達創傷部位的是中性粒細胞，釋放多種細胞因子與多種趨化因子招募血液中的循環單核細胞，并分化成巨噬細胞[8，18]，隨后巨噬細胞將誘導中性粒細胞凋亡并吞噬死亡細胞與壞死組織，在后續的炎癥反應中占據主導地位。巨噬細胞對組織微環境非常敏感，并具有極高的可塑性，可依據不同信號刺激極化為不同表型發揮不同功能[19]。材料植入初期，巨噬細胞通常在IFNγ、LPS 或TNF-α 的刺激下極化為M1 型（促炎型）巨噬細胞，分泌IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α 等多種促炎細胞因子；在IL-10 或IL-4 的誘導下巨噬細胞可極化為M2 型（抗炎型），分 泌IL-10、TGF-β等多種抗炎細胞因子和PDGF、EGF、VEGF 等多種生長因子，促進組織修復與再生[20]。大量報道指出，M1 型巨噬細胞數量與炎癥疾病的治愈程度呈正相關，而M2 型巨噬細胞數量則呈負相關，或兩種極化狀態的細胞比例對炎癥的消退具有很大影響[21-22]。與細菌、病毒性炎癥不同，生物材料植入后同樣招募大量巨噬細胞，巨噬細胞黏附于材料表面并分泌纖維蛋白基質，試圖對材料進行吞噬或降解。但通常材料不能降解或降解緩慢，這使得巨噬細胞不能發揮其強大的吞噬功能而受到“挫敗”，進而融合成為體積更大的異物巨細胞，企圖通過釋放活性氧（ROS）與降解酶將植入組織的材料降解，這一行為被稱為受阻吞噬作用[1]。對生物材料植入引起的炎癥反應而言，M1 型巨噬細胞數量過多會引起過度炎癥，導致組織受損；M2 型巨噬細胞數量過多會在材料周圍形成較厚的纖維包囊，導致材料植入失敗，但M1 和M2 型巨噬細胞在炎癥消退與材料整合方面發揮著不同但同樣重要的作用。因此，生物材料植入體內后能否正常發揮預期功能很大程度上取決于免疫反應，穩定M1 與M2 型巨噬細胞數量及選擇性抑制的調控策略成為提高生物材料相容性的關鍵。

活化的巨噬細胞可以招募并誘導纖維細胞轉化為成纖維細胞，促進組織修復與纖維化[23]。成纖維細胞在生物材料植入部位增殖，產生大量細胞外基質與高水平的基質金屬蛋白酶（MMP）、血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等多種促生長因子以替換或重塑受損組織[24]。M2型巨噬細胞分泌的IL-4、IL-13 等抗炎因子可以促進成纖維細胞分化，相反M1 型巨噬細胞分泌的IFN-γ、TNF-α 可以抑制成纖維細胞分化[25]，因此，巨噬細胞極化表型在一定程度上決定了生物材料周圍主要浸潤細胞群體類型。在炎癥反應后期，由以產生IL-10 和TGF-β 為標志的M2 型巨噬細胞主導修復階段，成纖維細胞可與這些抗炎因子產生反應從而促進修復作用[26]。有報道指出，M2 型巨噬細胞中的SMAD3 信號轉導可將巨噬細胞轉化為成纖維細胞[27]；也有研究推測，一定條件下成纖維細胞也可以轉化為巨噬細胞[25]，但該假設目前沒有文獻證據支持。相似的，巨噬細胞與其他免疫細胞也存在相互作用，并主導炎癥反應的發展方向。

3 細胞-材料復合物與免疫細胞的相互作用

組織工程中常以支架材料作為種子細胞或其他生物活性物質的承載媒介，為組織損傷與重建開辟了廣闊的前景。對于此類支架材料，不僅需要符合生物相容性評價標準，還要具有良好的細胞親和性與生物可降解性[28]。目前有大量研究應用支架材料模擬出細胞分化增殖所需的仿生微環境，促進種子細胞的生長發育，使其分泌細胞外基質或膠原蛋白完成組織修復[29]。Wang 等[30]將BMSC 與新型3D 水源性絲素蛋白支架結合，并驗證了其在組織工程中的實用性，間充質干細胞能夠在這種支架中成功地黏附、增殖和分化，3 周后構建體內部具有足夠的ECM 積累，這對于獲得穩定的機械性能是必需的。該研究證明了支架材料作為種子細胞載體的廣闊應用前景；另外，Wang 等[31]在膠原材料支架上搭載重組骨膜素蛋白促進內源性肌腱干/祖細胞的募集，完成肌腱的再生與修復，并且再生的肌腱顯示出機械性能和運動功能的恢復。目前，組織工程中常用的支架材料是天然來源的高分子材料，如膠原蛋白、明膠、絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽等，這些材料具有較好的生物相容性與細胞親和性，但其力學性能與可調控降解性較聚氨酯、聚酯纖維、聚乳酸等合成高分子材料差[32]。Hong 等[33]將膠原包被聚乳酸（PLA）微載體與交聯殼聚糖水凝膠相結合，設計并制備了一種新型可注射支架結構，該結構同時具有膠原的良好生物相容性與聚乳酸的優異機械性能。

針對支架材料的研究，往往聚焦于支架材料與種子細胞間的相互作用上，而忽略了支架材料植入體內后與機體免疫系統的相互作用。Kudva 等[34]使用明膠微球作為釋放TGF-β1的載體以促使軟骨再生，但動物體內非常多的細胞具有TGF-β 受體，如巨噬細胞、成纖維細胞、T 淋巴細胞、B 淋巴細胞[35]，TGF-β 的釋放可能會抑制免疫活性細胞的增殖，抑制PBMC 中IFN-γ 和TNF-α 的產生或促進成纖維細胞、成骨細胞和施萬細胞的生長。因此，細胞-支架復合物或生物活性分子-支架復合物的生物相容性評價，必須要考慮到種子細胞或因子與宿主免疫系統的相互作用。巨噬細胞介導的吞噬或降解作用是否會對種子細胞或支架材料自身造成影響，從而導致植入修復失敗；支架材料植入后M1 型巨噬細胞介導的強烈炎癥反應，是否會對種子細胞生長發育環境造成影響，這些問題現在仍然沒有確切的答案，同時也沒有針對性的生物學評價方法，成為了植入手術失敗或引起其他疾病的安全隱患。因此，我們在進行細胞-材料復合物等類似材料評價時，應當聚焦宿主免疫細胞的動態行為，以材料植入后炎癥發展進程為指導，負反饋于支架材料與種子細胞設計，使其更好地服務于組織工程與再生醫學。

4 巨噬細胞動態表征是評價生物材料植入后炎癥反應的重要指標

在生物材料植入的背景下，對巨噬細胞的動態行為進行表征作為材料整合和組織再生的指標[36]。早期生物材料的大部分研究都是通過體外試驗進行的，隨著分子克隆技術的發展，各種模式動物以及動物模型逐漸建立，使我們對材料與免疫系統的相互作用有了更加深刻的了解。現階段評價使用的動物模型以鼠類為主，雖然小鼠與人類免疫細胞亞群具有高度同源性，但也有大量報道指出兩個物種之間存在免疫學差異[37-38]，也有研究提出使用人源化小鼠模型進行生物材料免疫反應評價[39]，這些免疫學差異是否會導致在小鼠體內模擬的生物相容性評價不能完全適用于人類？這仍需要我們進一步研究證實。另外，Hachim 等[40]報道生物材料植入年輕與年老的小鼠中引起的免疫反應有差異，包括巨噬細胞的募集、標志物表達、細胞極化均存在不同；也有研究指出新生兒與成年人相比具有獨特的巨噬細胞極化表型，不適用于M1與M2 型分類[41]。由此可見，對于生物材料相容性評價不僅要評估材料本身是否滿足安全有效性，也需要依據材料受眾的個體差異設計更加完善、適用的評價方法。

在體內復雜的微環境中，M1 型與M2 型巨噬細胞并不代表所有巨噬細胞的極化狀態，除此之外還有未完全極化的M1 樣與M2 樣巨噬細胞、共表達M1 與M2 型標志物的巨噬細胞，M1 與M2 可以被看作兩種功能表型的極端狀態且在特定條件下可以復極化[42-44]。因此，我們可能需要依據巨噬細胞的標志物、分泌的細胞因子及基因表達水平，對巨噬細胞進行更加準確的分類并判定功能狀態，更好地探索巨噬細胞與生物材料在體內的相互作用。現在對生物材料的改造都以調節巨噬細胞極化方向為目標，比如通過細胞因子誘導巨噬細胞極化為抗炎表型、通過改變生物材料的物理化學性質進行調節，還有脫細胞基質、炎性介質順序遞送等方法[45]。由Dai等[46]研究制備的BaTiO3/P（VDF-TrFE）鐵電納米復合膜材料能構建仿生電學微環境，對材料進行電暈計劃處理后，鐵電納米復合膜產生剩余極化，形成的表面電勢能夠改善局部免疫微環境，誘導巨噬細胞表型由M1 型向M2 型轉化，并可抑制IL-6、TNF-α 等促炎細胞因子的表達，明顯提高修復效果。Yang 等[47]通過自主開發的脂質體表面修飾技術，在電紡纖維表面上建立了細胞膜仿生涂層，通過表面修飾降低了植入后的炎癥反應程度，促進巨噬細胞向M2 型極化，并能降低異物反應，促進細胞浸潤。這些材料改造方式都是通過調節免疫微環境來誘導巨噬細胞向M2 型方向極化，但免疫調節因子的釋放時間與濃度需要精確控制，存在破壞局部組織穩態的風險。因此，對創新型生物材料的評價需要依托巨噬細胞的動態行為，建立起適合免疫調節類材料生物相容性的評價方法。生物材料介導的巨噬細胞極化免疫調節是未來組織工程材料設計的一個有希望的方向[48]，同樣，以巨噬細胞為媒介進行材料生物相容性評價也一定是一個充滿希望的方向。

5 討論與展望

綜上所述，生物材料植入后引起的免疫反應亦正亦邪，有利的免疫反應能夠促進創傷愈合、組織修復與再生，使材料發揮理想作用；不利的免疫反應會引起慢性炎癥、形成纖維包囊，導致植入失敗或組織壞死。這些“利弊”的形成與調控關鍵在于巨噬細胞[49]，盡管中性粒細胞、樹突狀細胞、T 細胞等多種免疫細胞參與生物材料植入后的炎癥反應，但巨噬細胞在材料整合、組織修復以及纖維化中的作用是至關重要且不可或缺的。目前，對生物材料植入過程中調節巨噬細胞功能的確切機制尚不完全清楚，但它們在修復和再生過程中的關鍵作用，使它們成為設計組織愈合與再生策略時的主要目標。同樣，生物材料相容性評價也應當聚焦巨噬細胞的數量與行為，通過表征、成像或三維重建等前沿科技手段量化炎癥反應強度。隨著材料學、免疫學與分子生物學的交叉融合，我們能夠建立更便捷、更精確的評價方法，對材料生物相容性的評價應當深入到細胞水平、分子水平乃至基因水平。

對于醫療器械檢定行業而言，蘇木精-伊紅（HE）染色與免疫組化等傳統病理分析方法雖然能滿足檢測產品生物相容性的需要，但因其試驗周期長、非特異性染色不能有效解決、結果判定缺乏客觀性等局限性，使得部分醫用生物材料植入人體仍然具有一定風險，可能導致長期炎癥、組織壞死甚至癌癥。隨著醫療器械行業的發展，通過新技術、新理念、新方法研究出來的生物材料屢見不鮮，但現行評價標準規范中的實驗方法已不能滿足對新型生物材料全面、科學評價的需求，尤其是需要長期甚至終生與人體相接觸的材料和具有組織誘導、免疫調節功能的生物材料，其潛在的生物安全風險需要更加全面的評價。近幾年模式動物與小動物成像逐漸成為相關研究中的常用的實驗方法，今后或許可以將模式動物與生物相容性評價結合起來，將活體成像與巨噬細胞結合起來，將巨噬細胞數量、極化狀態與炎癥反應強度結合起來，以巨噬細胞為媒介建立起更加全面、客觀、準確、高效的生物相容性評價方法。