分子熒光光譜法測定富硒大米中的痕量硒

羅建民 彭翠紅 楊智威

(韶關學院 化學與土木工程學院，廣東 韶關 512005)

硒是人類和動物必需的微量元素，它是紅細胞中谷胱甘肽過氧化物酶的一種成分。其主要功能是參與酶的合成，保護細胞膜的結構和功能免受過度氧化損傷，具有抗癌、解毒、護肝和提高人體免疫力的保健功能[1]。20世紀90年代初，中國總膳食結構調查顯示，居民每日膳食硒平均攝入量為43.3 g/d，低于中國營養學會推薦的下限(50 g/d)[2]，我國有2/3的國土和地區處于缺硒狀況，通過天然食物獲取硒，遠遠不能滿足人們對硒的需要，同時，大米在國內的相當一部分地區，還是每天必不可少的食物。因此，分析不同地區富硒大米的硒含量有著重要的意義。

硒元素的主要分析方法有原子吸收光譜法包括石墨爐原子吸收光譜法和氫化物發生原子吸收光譜法[3]、電化學分析法包括溶出伏安法[4]、極譜法以及電位分析法[5]、熒光光譜法包括分子熒光光譜法及氫化物-原子熒光譜法[6]。痕量硒的測定方法中，可見分光光度法和比色法[7]所用的儀器設備操作簡單，但靈敏度低，試劑不穩定；石墨爐-原子吸收光譜法[8]的檢測靈敏度相對較低，受背景干擾嚴重，穩定性差；電化學方法[9]是近年來發展快速的測定方法，靈敏度較高，但存在干擾嚴重的問題。目前報道富硒大米中硒含量的檢測，主要采用電感耦合等離子體質譜法和原子熒光光譜法，這兩種方法的準確度、靈敏度高，但這兩種方法儀器設備比較貴，難以在基層實驗室推廣。分子熒光光譜法也具有上述所說的優點，但用來測定富硒大米中硒含量研究的文獻卻很少，因此本文擬采用分子熒光光譜法測定富硒大米中的痕量硒，通過探究體系酸度pH值、水浴反應時間、DAN用量以及表面活性劑等對體系熒光強度的影響，確定分子熒光光譜法中痕量硒的最佳測定條件，將方法應用于三種富硒大米中痕量硒的測定。為痕量硒的分析及人們在飲食過程中攝入適量的硒，合理搭配膳食、保障人體健康提供方法及數據參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

硒標準儲備溶液(100.0 μg/mL)，使用時用1%的鹽酸溶液稀釋成0.05 μg/mL硒標準使用液，備用；

2，3-二氨基萘(DAN) 溶液(1 g/L)、EDTA-鹽酸羥胺混合液：參照GB/T 5009.93-2017《食品中硒的測定方法》配制；CPB(溴化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、CPC(氯化十六烷基吡啶，1.0×10-5mol/L)、DTAB(十二烷基三甲基溴化銨，1.0×10-5mol/L)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、鹽酸羥胺、環己烷、高氯酸、硝酸、鹽酸均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。

1.2 主要儀器及工作條件

F-380型分子熒光光度計(港東科技公司)。工作條件：電壓340 V，燈電流100 mA，狹縫寬度10 nm，掃描速度1 200 nm/min，增益1，重復1次。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

將大米樣品去除雜物后，用石英研缽充分磨碎，磨碎后的樣品儲存于塑料瓶中；稱取1.0 g(精確至0.000 1 g)試樣置于錐形瓶中，加5 mL硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及幾粒玻璃，蓋上表面皿浸泡過夜。次日于電熱板上消解至澄清透明，冷卻后定容(同時做試劑空白實驗)。

1.3.2 硒的測定

準確移取4.00 mL 50 μg/L硒標準溶液于錐形瓶中，加入15.00 mL EDTA-鹽酸羥胺混合溶液，用鹽酸溶液(1+9)調節pH值，在暗室中加入一定量 DAN溶液，水浴鍋加熱至60～100 ℃，加熱一定時間，冷卻后加入3.00 mL環己烷，2.00 mL表面活性劑溶液(1.0×10-5mol/L)，振搖5 min，將溶液全部移入分液漏斗中，靜置分層后，將上層的環己烷移入比色管中，測量環己烷萃取液的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 硒測定的熒光光譜及測定波長選擇

按實驗方法得到萃取測定液，在300～400 nm波長范圍內進行掃描得激發光譜，500～600 nm波長范圍內進行掃描得發射光譜，硒(Ⅳ)與DAN在酸性條件下反應生成強熒光物質，其最大激發波長和發射波長為λEx/λEm= 373 nm/521 nm，如圖1所示。因此，選擇521 nm作為熒光測定波長。

圖1 硒測定的激發與發射光譜Figure 1 The excitation and emission spectra of Se determination.

2.2 硒的熒光測定條件選擇

2.2.1 DAN用量對體系熒光強度的影響

準確移取4.00 mL硒標準溶液(50 μg/L)加入5個錐形瓶中，在暗室中分別加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL DAN溶液(1 g/L)，按照實驗方法，其他條件不變，加入3.00 mL環己烷、2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)萃取后，測定環己烷層萃取液的熒光強度，如圖2所示，在加入DAN 2.00～3.00 mL時，體系熒光強度趨于穩定，當DAN加入量為3.00 mL時，體系熒光強度最強。故實驗選擇DAN用量為3.00 mL。

圖2 DAN用量對硒測定熒光強度的影響Figure 2 Effect of the amount of DAN on fluorescence intensity.

2.2.2 表面活性劑對體系熒光強度的影響

選擇3種陽離子表面活性劑十六烷基溴化吡啶(CPB)、十六烷基氯化吡啶(CPC)以及十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)探究其對硒測定體系熒光的影響。分別準確移取4.00 mL硒標準溶液(50 μg/L)加入5個錐形瓶中，按照實驗方法，加熱冷卻后，分別加入3.00 mL環己烷，2.00 mL 1.0×10-5mol/L的CPB、CPC及DTAB萃取分液后，測量環己烷萃取液的熒光強度，結果見表1。

表1 不同表面活性劑對體系熒光強度的影響

由表1可以看到，在加入不同的陽離子表面活性劑后，體系的熒光強度相較于不加表面活性劑都有一定程度的增強，其中加入CPB后，體系熒光強度的增加幅度最大。如圖3所示加入CPB后，體系熒光強度明顯增強，其原因是添加表面活性劑后與熒光物質形成了膠束，形成的膠束能增大體系的黏度，從而降低了在熒光反應時的碰撞猝滅[10]。故實驗選擇加入CPB為表面活性劑。

圖3 加CPB前后硒測定的熒光光譜Figure 3 The fluorescence spectra of Se determination before and after adding CPB.

2.2.3 溶液酸度對體系熒光強度的影響

由于熒光物質自身為弱堿或弱酸，熒光強度隨分子和離子在不同酸度水平下平衡的變化而變化，因此按照實驗方法，只改變體系的pH值，分別用鹽酸溶液(1+9)調節至pH = 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，其他條件不變，加入2.00 mL CPB溶液(1.0×10-5mol/L)，測量環己烷萃取液的熒光強度，結果如圖4所示，當pH=2.0時，體系熒光強度最大。故實驗選擇溶液的pH值為2.0。

圖4 pH值對硒測定體系熒光強度的影響Figure 4 Effect of pH on fluorescence intensity.

2.2.4 水浴反應溫度對體系熒光強度的影響

按照實驗方法，只改變水浴反應溫度，分別在水浴溫度60、70、80、90、100 ℃下加熱10 min，其他條件不變，測量環己烷萃取液的熒光強度，結果如圖5所示。結果表明當水浴溫度在70～90 ℃時，體系熒光強度趨于穩定，在80 ℃ 下進行水浴加熱時體系的熒光強度最高。故實驗選擇水浴溫度為80 ℃。

圖5 水浴溫度對體系熒光強度的影響Figure 5 Effect of water bath temperature on fluorescence intensity.

按照實驗方法，只改變水浴反應時間，即在水浴溫度80 ℃下分別加熱5、10、15、20、25 min，其他條件不變，最后用環己烷萃取液測量溶液的熒光強度，結果如圖6所示。當水浴反應時間在5～10 min時，體系熒光強度趨于穩定，反應時間為10 min 時，體系熒光強度最大。故實驗選擇反應時間為10 min。

圖6 水浴反應時間對硒測定體系熒光強度的影響Figure 6 Effect of water bath time on fluorescence intensity.

2.3 穩定性與干擾實驗

2.3.1 穩定性實驗

按照實驗方法進行硒測定體系的穩定性實驗，將環己烷萃取液分別在5、10、15、20、30、40、60 min 時測定其熒光強度，結果見圖7，表明在1 h內體系的穩定性良好。

圖7 硒測定體系的穩定性Figure 7 The stability of Se determination.

2.3.2 干擾實驗

按實驗方法測定0.2 μg/mLSe(Ⅳ)，相對誤差≤±5%時，考察了Hg2+、Cu2+、Pb2+對硒測定的干擾，在高于50倍硒量的汞離子、銅離子及鉛離子存在量下不會對硒測定產生干擾。

2.4 硒測定的標準曲線和檢出限

分別吸取0、0.20、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 硒標準溶液(50 μg/L)，按照實驗方法，得到硒測定的標準曲線，如圖8所示，硒測定的線性范圍為0～0.067 μg/mL，其線性回歸方程If=1775c-0.3165，相關系數r=0.9991。進行11次空白實驗，標準偏差σ為3.81×10-2μg/mL，按照cL=3σ/k計算該方法檢出限為6.5×10-4μg/mL，表明該方法測定硒靈敏度較高。

圖8 硒測定的標準曲線Figure 8 The standard curve of Se determination.

2.5 樣品分析

2.5.1 大米中硒含量的測定

通過電子商城等途徑采購了三種產自不同地區不同品牌的富硒大米，分別測定其中的硒含量。如表2所示，來自湖北的1#富硒米中硒含量最高，為283 μg/kg，湖南的2#為182 μg/kg，來自黑龍江五常地區的最低，為126 μg/kg，但都達到了包裝上營養成分表中關于硒含量的營養指標要求。

表2 不同種富硒米中硒含量

2.5.2 加標回收實驗

在三種富硒大米消解后的樣品中加入不同量的硒標準溶液，按實驗方法測定硒含量，平行測定5次，計算其加標回收率，結果如表3所示，三種樣品的回收率在87.8%～107%，均符合測定要求，方法可行。

表3 加標回收實驗結果

3 結論

優化了分子熒光光譜法測定痕量硒的實驗條件，其最佳測定條件：水浴溫度 80 ℃下加熱10 min，pH值控制在2.0，DAN用量為3.00 mL、加入CPB陽離子表面活性劑；硒測定的方法檢出限低，提高了測定硒的靈敏度；將該方法應用于三種產自不同地區的富硒大米中痕量硒的測定，其相對標準偏差均小于3.0%，表明測定結果良好。